CNVplex聯合STR技術在復發性流產遺傳學查因中的應用*

楊 嵐，楊月芬，王俏霞，許逸琴，楊燦鋒，肖建平△

(南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院：1.產前診斷中心；2.計劃生育中心，江蘇無錫 214002)

論著·臨床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.04.005

CNVplex聯合STR技術在復發性流產遺傳學查因中的應用*

楊 嵐1，楊月芬2，王俏霞2，許逸琴2，楊燦鋒1，肖建平1△

(南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院：1.產前診斷中心；2.計劃生育中心，江蘇無錫 214002)

[摘要] 目的 運用快速檢測絨毛染色體拷貝數變化的方法探討復發性流產查因途徑。方法 對60例反復自然流產病例的絨毛樣本(孕13周前)分別進行多重DNA拷貝數(CNVplex)和熒光原位雜交(FISH)技術檢測，所有樣本同時行絨毛培養核型分析驗證。結果 48例培養成功的復發性流產病例，染色體異常率為60.42%。其中48例CNVplex檢測結果與核型分析相一致：包括20例染色體正常者、23例常染色體三體，3例三倍體和2例45，XO(Turner綜合征)；而FISH檢測結果中與核型分析結果相符的只有38例。對于非嵌合體和非結構異常樣本，兩種方法與細胞遺傳學核型分析結果符合率分別為100%(CNVplex)和79.17%(FISH)。結論 應用CNVplex 聯合短串聯重復序列(STR)技術可檢測絨毛染色體拷貝數及檢測5 Mbp以上的重復和缺失異常，利于分析流產病因。

絨毛膜絨毛；流產,習慣性；染色體；非整倍體；核型分析；拷貝數變化

[Abstract] Objective The study is to present a novel assay for rapid detection of fetal aneuploidies in chorionic villus for spontaneous abortion.Methods Fetal chorionic villus samples were collected from 60 cases of women diagnosed with recurrent spontaneous abortion (RSA) before 13 weeks gestation.All samples were analyzed using CNVplex (copy number variations multiplex) assay and fluorescence in situ hybridization (FISH) in addition to chromosome analysis.All villi specimens were cell cultured and karyotyped to confirm the fetal chromosomal status.Results Among 48 successfully cultured and karyotyped samples,the chromosomal abnormality rate was 60.42%.The results of karyotyping and the CNVplex assay were identical,both yielding 20 cases of euploidies,23 autosomal aneuploidies,3 triplodies and 2×monosomies(Tumer Syndrome).However,FISH obtained only 38 results identical to karyotyping.Two cases of deletion and duplication of chromosome were also identified by CNVplex but not always by karyotyping.As for non-mosaic and non-structural abnormity samples,the concordance between cytogenetics and genotyping was 100% in CNVplex and 79.17% in FISH.Conclusion With CNVplex combined with STR(short tandem repeat) assay,we can detect the aneuploidy abnormalities as effectively as routine karyotyping without the need for cell culture,while also analyzing deletions and duplications(larger than 5 Mbp) that are not always detected by karyotype analysis.Our study demonstrates that CNVplex assay is an efficient,convenient,and accurate method to explore the etiology of miscarriage.

自然流產是婦產科的常見病、多發病之一，發生率達全部妊娠的15%，近年有上升趨勢。其原因眾多，涉及遺傳、解剖、免疫、內分泌、感染、環境及其他未知因素等[1]。遺傳因素尤其是染色體異常通常被認為是最常見的自然流產病因，研究證實，孕早期自然流產染色體異常發生率達50%～60%[1-2]，其中多數為染色體數目異常[3-6]。因此對早期停育胚胎進行染色體分析十分重要。核型分析雖被認為是判斷染色體結果的金標準，但從培養的絨毛細胞獲取核型結果需時較長，且有一定的失敗率。現今多種方法如PCR或FISH可用于檢測染色體非整倍體異常[7]，其他諸如QF-PCR、NGS、CMA等雖都有不需細胞培養和快速診斷的優勢[2，8-9]，但尚缺乏兼具低成本、高效、應用范圍廣的分子檢測技術。本研究選用多重DNA拷貝數(CNVplex)聯合短串聯重復序列(STR)技術針對復發性流產組織進行24種染色體的拷貝數檢測，通過兩種方法的陽性符合率比較，旨在探討CNVplex聯合STR技術在流產組織染色體快速診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014-2015年經超聲診斷胚胎停止發育在本院行清宮手術的孕婦60例，患者平均年齡30.5歲，排除全身性感染、外力、負重等因素。孕齡為48～91 d。清宮手術時無菌采集絨毛組織約10 g，顯微鏡下挑選絨毛50 mg左右，經處理分別按CNVplex技術及熒光原位雜交(FISH)法檢測，所有樣本同時進行絨毛細胞核型分析。

1.2 方法

1.2.1 絨毛細胞培養法 無菌采取清宮術標本放入無菌杯中，按標準方法[10]用無菌生理鹽水洗滌后，于顯微鏡下挑取優質絨毛組織，切成碎片，接種于羊水培養基的培養瓶中，置37 ℃，5% CO2培養箱培養。靜置6～7 d后，在倒置顯微鏡下觀察，見到梭形細胞克隆后給予換液；繼續培養2～3 d，當出現較多圓形細胞時給予收獲。

1.2.2 染色體制備與核型分析 將秋水仙素(10 g/mL)加入培養瓶中繼續培養4 h后棄培養液，加入低滲液進行低滲處理20 min，再進行預固定、固定、制片，80 ℃老化2 h。常規G顯帶、姬姆薩染色。鏡下計數20個核型。分析5個顯帶良好分裂相，嵌合體則增加中期相計數。

1.2.3 FISH檢測 FISH根據13、16、21、22號染色體的單一序列探針，18，X，Y著絲粒探針來分析分裂中期的絨毛染色體。根據說明書進行雜交、洗滌、復染、熒光顯微鏡分析。7種不同的染色體熒光信號被用來分析每個樣本的100個細胞，按操作規范進行結果分析。

1.2.4 CNVplex和STR檢測 (1)樣本DNA提取：按常規提取方式對絨毛樣本進行DNA提取(濃度不能低于20 ng/μL);(2)連接反應：各反應管加入總量150 ng的相應體積的DNA樣本，滅菌蒸餾水補至8 μL，陰性對照加8 μL洗脫液。按說明書配制預混合液體系：混勻后每管分裝12 μL到反應孔中，置PCR儀上(ABI 2720 PCR儀)進行如下反應：98 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 3 h 5個循環；60 ℃保存。連接反應共15 h，反應結束后加入10 μL“終止液”終止反應并混勻；(3)連接產物多重熒光PCR擴增：對連接探針產物，進行多重PCR擴增。按說明書配制預混合液體系：混勻后每管分裝19 μL，加入1 μL連接產物，置PCR儀上進行擴增： 95 ℃ 5 min ；5×(94 ℃ 20 s，62 ℃-1 ℃/cycle 40 s，72 ℃ 1.5 min)；94 ℃ 20 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min,27個循環；68 ℃ 1 h；保存于4 ℃；(4)擴增產物熒光毛細管電泳分離：取1 μL擴增產物稀釋液與0.1 μL LIZ500，8.9 μL Hi-Di混勻，95 ℃變性5 min后置ABI測序儀(PRISM 3130XL)檢測。數據由Gene Mapper ID 4.0 (Applied Biosystems),CNVplex Converter (GeneSky)及CNV Reader 1.0 (GeneSky)軟件自動分析；(5)拷貝數計算;(6)結果判斷：如果連續5個以上目標區的拷貝數值為0.8～1.2，代表1個CNV拷貝;1.75～2.25代表2個CNV拷貝;2.7～3.3代表3個CNV拷貝;3.6～4.4代表4個CNV拷貝。如果連續3個以上目標區的拷貝數值偏離正常拷貝數，并且至少2個檢測值的拷貝數為1，則這些探針決定區域判定為缺失(0～0.1或0.8～1.2)或重復(2.7～3.3)。如果一染色體上至少連續3個探針的拷貝數值在2.25～2.7，則提示可能為嵌合體或母血污染樣本。(8) STR檢測:選取染色體2、4、5、7、8、10、11、12、13、15、16、18、X,Y上高雜合度的17個位點設計引物，對母血及絨毛組織樣本分別進行17個STR位點的檢測，同時對17個多重熒光PCR產物進行毛細管電泳分析，通過比較檢測到的兩者位點來源判斷絨毛組織有無母血污染。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計處理，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 核型分析結果 在60例絨毛培養病例中，培養成功率80%(48/60)，其中陽性率為60.42% (29/48)，異常結果中，最常見的是16 (20.69%),21 (13.79%),22 (10.34%)號三體,三倍體 (10.34%)；其次為X單體，15，13三體(均為6.9%)；最少見的是3,7,10,11,12,和20號三體。同時筆者發現2例常染色體三體同時伴有9號臂間倒位；1例12三體伴有8號染色體短臂末端缺失，見表1。

表1 應用CNVplex,FISH和核型分析檢測的胎兒染色體結果

續表1 應用CNVplex,FISH和核型分析檢測的胎兒染色體結果

*：由mini-STR assay檢測到的母血污染樣本;a:χ2=11.16,P<0.01，與CNVplex比較。

2.2 FISH檢測結果 在48例培養成功的絨毛樣本中，FISH檢測成功率(100%)。其中包括6例16三體，4例21三體，3例22三體，3例三倍體，13三體和X染色單體各2例，以及28例整倍體。與核型分析結果比較，FISH檢測的異常率為41.67%(20/48)，另外8例三體征樣本由于FISH探針的限制未能檢出。FISH檢出兩例嵌合體(46,XY,60%/47,XY,+21,40%；69,XXX,40%/46,XX,60%)，但最后被核型分析排除。與核型分析結果相比，FISH檢測總的符合率為79.17% (38/48)。

2.3 CNVplex檢測結果 CNVplex檢測和核型分析獲得了47個樣本的一致結果，包括19例正常整倍體，23例常染色體三體，3例三倍體，2例X染色單體。此外，CNVplex還檢出了1例12三體伴8p23.1:del(34 Mbp);18p11.21:dup(6 Mbp)，見圖1。1例46,XX伴8p23.1:del(5 Mbp);8q24.13:dup(7 Mbp)，但這2例重復和缺失沒有全部被核型分析所檢出。在CNVplex方法中，在染色體數目異常的結果符合率為100%。同時，聯合STR檢測兩例絨毛樣本被證實有母血污染，見表1，圖2，3。綜上，CNVplex對絨毛樣本的檢測成功率為100%，結果異常率為60.42% (29/48)。

圖1 病例 47,XY,+12;(8p del;18p dup) 的CNVplex拷貝數檢測結果示意圖

STR對D7S820位點的分型檢測提示該絨毛樣本的雙等位基因A11,A9分別遺傳其父母。

STR對D13S317位點的分型檢測示該絨毛樣本一等位基因A11系遺傳其父親，而另外與其母相同的A8，A12等位基因均在絨毛中檢測到，含母血污染。

3 討 論

CNVplex高通量基因拷貝數檢測技術(以下簡稱CNV plex技術)是在多重連接探針擴增技術(MLPA)基礎上改進的一個新技術，它與MLPA比較，優勢在于探針分布廣，CNVplex每條染色體設計5～8個探針，24種染色體共計170個探針，保證了染色體覆蓋的廣度和深度，同時配以質控探針，使檢測結果更精準，其操作更簡便，快捷，通量高。該技術除可檢測24種染色體數目異常，還可檢測5 Mbp以上的缺失或重復，同時對可疑母血污染的絨毛及母血樣本的DNA采用STR技術可檢測個體識別位點而明確樣本是否受母血干擾，也可檢出比較基因組雜交(CGH)技術不能檢出的多倍體異常。準確的遺傳學檢測可減少異常流產患者不必要的額外檢查，減輕其心理壓力[11-12]。比較本研究兩種方法與核型分析結果的符合率[(79.17%(FISH)vs.100% (CNVplex)]，對于非嵌合體和非結構異常樣本，本研究結果顯示CNVplex技術可快速、準確地檢測所有染色體數目異常，與FISH技術相比顯得更有效(P<0.01)。雖然FISH技術可通過分析更多細胞對嵌合體提供較傳統核型分析更精確的估計[13]，但本研究采用的FISH探針僅能檢出7種染色體異常，且無法排除母血污染。經FISH檢測出的兩例嵌合體46,XY,60%/47,XY,+21,40%和69,XXX40%/46,XX,60%，最終由核型分析分別驗證為47,XY,+21和69,XXX，該結果由STR檢測發現為母血污染所致。對于FISH技術，盡管對于13，16，18，21，22三體，X單體，三倍體等數目異常的檢測靈敏度是100%，但如不加以核型分析，會有28.6%的數目異常病例漏檢。如需檢測所有染色體，將極大增加FISH探針的試驗成本，也不適于臨床的廣泛應用。

雖然細胞遺傳學核型檢查是診斷的金標準，能在較低分辨率下分析所有染色體的數目和結構異常，但由于流產絨毛的性狀問題等有較高的培養失敗率[8,14]，易出現漏診。核型分析可檢測平衡重排如易位、倒位等結構異常，本研究雖發現2例常染色三體伴9號染色體臂間倒位，但臂間倒位并非異常流產的主要原因，因而不影響CNVplex技術在產前檢測絨毛染色體異常的臨床應用。此外，CNVplex發現兩例缺失、重復異常(片段大小5～7 Mbp)，其中1例為46,XX:8p23.1:del(5 Mbp);8q24.13:dup(7 Mbp)，查詢OMIM和Decipher基因數據庫，8p23.1區域包含GATA4基因，文獻報道該基因的拷貝數異常可能影響胎兒心臟發育和導致胚胎停育[15]。對該病例，雖沒有染色體數目異常，但該區域缺失很可能是引起胚胎停育的主要因素。該異常在核型分析由于分辨率低而未能檢出。因而，CNVplex技術除了無需細胞培養、可快速檢測所有染色體數目異常，還能檢測核型分析無法檢出的5 Mb左右的結構異常，可潛在地作為替代侵入性核型分析的一種產前診斷胚胎染色體異常的檢測技術。

近年來，產前檢測胎兒非整倍體疾病的分子診斷技術陸續涌現，如Illumina測序平臺、ACGH、染色體微陣列分析技術(CMA)[16-18]。雖然這些方法有較高的分辨率和準確度，但其檢測成本遠高于CNVplex，此外，這些方法對生物信息學分析有著較高要求，且ACGH無法檢測三倍體。而QF-PCR也可檢測主要的三體征[8,19]，并能對產前樣本的母血污染檢測作出初步評估，但它無法檢測染色體結構異常。CNVplex的結果就非整倍體而言與核型分析結果都相一致，顯示了在流產絨毛遺傳檢測中的良好診斷價值。但其不足之處是無法判斷絨毛組織嵌合體樣本的比例，這可通過核型分析進一步明確。

本研究顯示復發性流產胚胎的非整倍體比例為60.42%，其中三體征最常見，占比79.3%(23/29)，與之前的報道相符[6,20]，其次為三倍體10.3%(3/29)，單體征6.9% (2/29)。對于染色體異常的咨詢意見：對絨毛染色體數目異常，多數研究已報道為受精卵形成過程中染色體不分離所致，如雙親染色體正常，在排除內分泌、免疫、感染、解剖因素后，可在優生指導下自然受孕，如反復出現流產，可采取胚胎植入前診斷來篩選正常胚胎；對于胚胎染色體結構異常者，可進一步檢查雙親，從而明確胚胎染色體結構異常的遺傳來源，再根據雙親染色體結果對下次受孕進行咨詢指導。而對于染色體正常樣本，其病因可能與接觸有害物質等環境因素有關[21,22]，或由某些特定基因的多態性或基因的插入/缺失導致[23-25]。這些亞顯微結構的遺傳學病因，需應用PCR-RFLP或基于單核苷酸多態性(SNP)的微陣列分析技術進一步加以明確[25-26]，這有待于我們進一步探討。

綜上，本研究表明CNVplex技術是一種快速、準確、低成本的可檢測流產組織染色體異常的新方法。準確提供遺傳學檢查結果不僅可有效減少異常流產患者的心理壓力，同時有助于臨床醫師進行有效的遺傳咨詢，在優生遺傳學領域有著重要的應用價值。

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Application of CNVplex combined with STR assay for genetic etiology exploration in chorionic villus of recurrent spontaneous abortion*

YangLan1,YangYuefeng2,WangQiaoxia2,XuYiqin2,YangCanfeng1,XiaoJianping1△

(1.PrenatalDiagnosisCenter;2.DepartmentofFamilyPlanning,WuxiMaternalandChildHealthHospitalAffiliatedNanjingMedicalUniversity,Wuxi,Jiangsu214002,China)

chorionic villus;abortion,habitual;chromosome,aneuploidy;karyotyping;copy number variation

R715.5;R711.6

A

1671-8348(2017)04-0446-04

2016-09-24

2016-10-22)