超高效液相色譜法測定糜子中4種B族維生素

田翔，王海崗，喬治軍

（1.山西省農業科學院農作物品種資源研究所，農業部黃土高原作物基因與種質創制重點實驗室，雜糧種質資源發掘與

遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原030031；2.山西省農業科學院，山西太原030031）

超高效液相色譜法測定糜子中4種B族維生素

田翔1，王海崗1，喬治軍2

（1.山西省農業科學院農作物品種資源研究所，農業部黃土高原作物基因與種質創制重點實驗室，雜糧種質資源發掘與

遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原030031；2.山西省農業科學院，山西太原030031）

建立同時測定糜子中4種B族維生素的超高效液相色譜法。糜子樣品用0.01 mol/L鹽酸超聲加熱溶解，醋酸鋅沉淀蛋白后提取濾液，采用Waters HCLASS超高效液相色譜儀，以C18柱為固定相，乙腈-1%甲酸溶液（pH＝2.63）為流動相，流速0.25 mL/min梯度洗脫，利用紫外檢測器在波長275 nm處進行檢測，分析時間為11 min。結果表明，維生素B1，B2，B6，B9這4種維生素線性關系良好，R2均在0.999以上，相對標準偏差（RSD）為0.42%～1.56%，回收率范圍為91.70%～101.02%。該法快速簡便，精密度好，結果準確可靠，適用于同時測定糜子中水溶性維生素的含量，可對糜子營養品質進行評價，鑒選優良種質。

糜子；超高效液相；維生素B

糜子的基本結構由4個部分組成，包括含有纖維素的麩皮，含較豐富營養素的糊粉層，含大量淀粉的胚乳，富含蛋白質、脂肪、礦物質、B族維生素和維生素E的谷胚[1]。糜子作為常見的谷物，是人們膳食金字塔中最基礎的部分，其最突出的營養特點是含有豐富的B族維生素。

B族維生素是水溶性維生素中重要的一類，其中多種是酶的輔基和酶的組成部分[2]。當人體內缺乏B族維生素時，可導致多種疾病的發生，而人體自身又無法合成這些化合物，必須通過食物或服用復合維生素制劑給予補充。隨著人們對生活品質要求的提高以及復合維生素制劑及高檔營養品的出現，測定谷物中B族維生素的含量引起了人們的廣泛關注。已有的B族維生素檢測方法很多[3-4]，如熒光法、微生物法、分光光度法、自動測定法、高效液相色譜法[5-7]和高效毛細管電泳法[8]等。這些方法多是針對某個單一維生素的測定，且超高效液相色譜法用于糜子中B族維生素的測定還未見報道。

本研究采用HPLC建立了糜子中B族維生素的測定方法，對樣品前處理方法進行了研究，并對儀器測定條件各影響因素進行了優化。該方法簡便快速，準確可靠，對糜子樣品中水溶性維生素的測定具有重要的參考價值。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

維生素B1（硫胺素）、維生素B2（核黃素）、維生素B6（鹽酸吡多醇）、維生素B9（葉酸）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純；氫氧化鈉、鹽酸、三氟乙酸、磷酸二氫鉀、醋酸鋅及辛烷磺酸鈉均為優級純。實驗用水均為二次蒸餾水。樣品材料為山西省農業科學院農作物品種資源研究所提供的山西河曲紅糜子。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀（Waters HClass，美國waters）；色譜柱：C18（2.1 mm×100 mm，1.8 m）；電子天平（BSA124S，德國Sartorius）；高速離心機（5804R，德國Eppendorf）；恒溫水浴鍋（HHS，上海博訊）；漩渦混合器（VORTEX-5，海門市其林貝爾）。

1.3 實驗方法

1.3.1 維生素標準儲備液的配制分別準確稱取10 mg維生素B1，B6標準品于25 mL棕色容量瓶中，加入15 mL濃度為0.01 mol/L的鹽酸溶液并充分振蕩，超聲15 min，待全部溶解后，用0.01 mol/L的鹽酸溶液定容，即得質量濃度為0.4 mg/mL的儲備液[9]。

分別準確稱取7.5 mg維生素B2，B9標準品于25 mL棕色容量瓶中，先用1.5 mL濃度為2 mol/L的NaOH溶液溶解后，再加0.01 mol/L的鹽酸溶液定容，超聲15 min，即得質量濃度為0.3 mg/mL的儲備液。低溫避光保存。

1.3.2 超高效液相色譜（UPLC）分析條件色譜柱為C18；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸（pH＝ 2.63）；柱溫20℃；紫外檢測器，波長275 nm；進樣體積5 μL；流速0.25 mL/min，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序如表1所示，分析運行時間11 min[10-12]。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 工作曲線的繪制分別吸取一定量的4種標準儲備溶液配成不同系列的濃度，于2 mL離心管中配成0.05～2 g/mL的混標溶液。按照1.3.2中的條件進樣，以峰面積對質量濃度繪制標準曲線，得到4種維生素的線性方程，并以3倍信噪比計算相應的檢出限[13]。

1.3.4 樣品預處理方法準確稱取5 g樣品置于50 mL離心管中，用20 mL 0.01 mol/L的鹽酸溶解，于50℃超聲提取2 h，加入2 mL 15%醋酸鋅混勻，以4 000 r/min離心10 min。用吸管吸取上清液置于另一個50 mL的離心管中，對殘渣按照上述步驟再次加入20 mL提取液重復提取一次，合并提取液于50 mL離心管中，用水定容，混勻，取濾液過0.22 μm水系濾膜，待上機[14-15]。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相選擇流動相的pH值對這4種水溶性維生素的保留時間有影響，pH值越大，保留時間越短，但考慮到柱子的耐酸范圍，確定pH值為2.63時最佳。

考慮到流動相的選擇對維生素的色譜分離效果影響較大，分別選擇了乙腈-0.01%三氟乙酸、甲醇-辛烷磺酸鈉及乙腈-0.1%甲酸作為流動相。實驗結果表明，利用乙腈-0.01%三氟乙酸作為流動相對混標液中4種維生素進行分離測定時，色譜峰發生重疊，分離效果較差。辛烷磺酸鈉溶液本身色譜峰值較大且保留時間長，對體系干擾較大。乙腈-0.1%甲酸作為流動相能較好地實現混標液中4種維生素的分離，結果如圖1所示。從圖1可以看出，乙腈-0.1%甲酸為流動相的分離效果較好，各維生素的出峰順序為：維生素B1、維生素B6、維生素B9、維生素B2。

2.1.2 紫外檢測波長的選擇將4種水溶性維生素分別在190～700 nm處作紫外光譜掃描，得到各物質的最大吸收波長，維生素B1為244 nm，維生素B2為266 nm，維生素B6為288 nm，維生素B9為280 nm。當以乙腈-0.1%甲酸為流動相，紫外檢測波長分別為260，275，280 nm時對混標進行分離。結果表明，波長調整后所有維生素的色譜峰積分面積均減小。因此，275 nm為合適波長。

2.1.3 流速對色譜分離效果的影響乙腈-0.1%甲酸為流動相，考察了流速分別為0.4，0.3，0.25mL/min時混標的分離效果。結果表明，當流速為0.25mL/min時分離效果最佳。

2.1.4 梯度洗脫條件在設定流動相A和B在不同組成比例下的洗脫狀況，根據4種維生素色譜峰的峰形、分離度和色譜分析時間，確定了流動相A，B在梯度起始和結束時的組成比例以及洗脫程序[16]。色譜條件：流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸，在4min內增加乙腈比例可以明顯縮短檢測時間，并增大分離度。

2.2 單標的UPLC圖譜

在最優條件下掃描4種維生素標準品的UPLC圖譜，維生素B1，B6，B9，B2標準品的UPLC保留時間依次為0.520，0.990，5.572，6.019 min。

2.3 標準曲線、線性范圍和檢出限

以標準溶液濃度為橫坐標c，峰面積為縱坐標y，得到回歸方程[17]。4種水溶性維生素均具有良好的線性，R2＞0.999，滿足檢測需要。方法的線性回歸方程、相關系數及檢出限結果列于表2。在本試驗方法所確定的實驗條件下，取一系列標準溶液進行超高效液相色譜測定，以峰面積y對濃度c（μg/mL）做圖，找出線性關系，并確定方法的最低檢測限。

表2 4種維生素的線性回歸方程與檢出限

2.4 精密度與回收率

本研究方法的回收率實驗選用已知B族維生素含量的糜子樣品為基質，設定了3個添加水平，對每個濃度樣品進行6次重復實驗[18]，測得4種水溶性維生素回收率和相對標準偏差（RSD）。維生素B1，B2，B6，B9的RSD分別為1.32%，0.42%，1.56%和0.92%，測定回收率分別為96.34%，97.01%，91.70%和101.02%，其回收率在91.70%～101.02%，測定結果的相對標準偏差（RSD）小于2%。

2.5 實際樣品檢測

分別用所建立的超高效液相色譜法測定糜子樣品中的水溶性維生素，得到的實際測定數據與國標法實測值進行比較，結果表明，相對誤差在1.5%～2.1%，均在允許范圍內，說明此法測得的糜子樣品的數據準確可靠，適用于糜子及谷物中水溶性維生素的同時測定。糜子中維生素B1，B2，B6，B9的含量分別為1 233.838，326.191，1 759.678，724.676 μg/100 g（圖2）。

3 結論

本實驗建立了同時進行測定糜子中的維生素B1，B2，B6，B9等4種水溶性維生素UPLC法，樣品經0.1%甲酸超聲提取，醋酸鋅沉淀蛋白，通過UPLC進行檢測，11 min內可完成4種水溶性維生素含量的測定，通過對高效液相色譜法條件的優化，控制流動相的pH值，可明顯地改善峰形和分離度，使用超高效液相色譜儀后縮短了保留時間，提高了檢測的準確度、精密度[19-20]。測定結果與國標法測定數據相比，結果均在允許范圍內，可對較寬濃度范圍內的糜子多種水溶性維生素進行同步分析，有助于提高糜子檢測的分析效率，降低成本，豐富糜子水溶性維生素品質評價體系，鑒選糜子優良種質。

4 討論

本研究將糜子中的4種B族維生素分離分析，實驗中提取溫度過高和光照對B族維生素可能產生破壞，但低溫提取率降低，因此，選擇酸性條件下超聲提取，也有用淀粉酶和高溫壓力提取技術，本實驗的提取條件較為簡單可操作。今后應對糜子中的其他水溶性有機物進行定性定量研究，對提取方法進行探索，盡量避免其他物質如色素等產生，本研究只是一個初步結果，今后將對糜子中的B族維生素化合物進行全面探索研究。

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Simultaneous Determination of Four Water-soluble B Vitamins inPanicum miliaceumL.by Ultra Performance Liquid Chromatography

TIANXiang1，WANGHaigang1，QIAOZhijun2
（1.KeyLaboratoryofCrop Gene Resources and GermplasmEnhancement on Loess Plateau，MinistryofAgriculture，Shanxi Key LaboratoryofGenetic Resources and Genetic Improvement ofMinor Crops，Institute ofCrop GermplasmResources，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

To establish simultaneous determination of 4 kinds of water-soluble vitamin B in Panicum miliaceum L.used by ultra performance liquid chromatography（UPLC）,samples were dissolved by ultrasonic heating with 0.01 mol/L of hydrochloric acid and filtrate was extracted after protein was precipitated byzinc acetate.C18was stationary phase and acetonitrile-1%formic acid solution was moving phase.Gradient elute was done at the rate of 0.25 mL/min.Detection was done at 275 nm of wave length used by ultraviolet detector and analysis time was 11 min.The result showed that linear relations of vitamin B1,vitamin B2,vitamin B6,and vitamin B9were good.Average value of R2was over 0.999.Relative standard deviation was 0.42%-1.56%,while recovery rate was 91.70%-101.02%. The method is fast,convenient,accurate and reliable,can be applied in determining content of water soluble vitamin and appraising and selectingexcellent Panicum miliaceum L.germplasmresources.

Panicum miliaceum L;UPLC;vitamin B

S516

A文獻標識碼：1002-2481（2017）02-0183-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.08

2016-07-14

現代農業產業技術體系建設專項（CARS-07-13.5）；山西省農業科學院攻關項目（ygg1514）

田翔（1982-），女，山西太原人，助理研究員，碩士，主要從事農作物品質分析研究工作。喬治軍為通信作者。