IL-18對胰腺星狀細胞及其趨化因子CX3CL1表達的影響

王茜 陳浩宇 陳潔

·論著·

IL-18對胰腺星狀細胞及其趨化因子CX3CL1表達的影響

王茜 陳浩宇 陳潔

目的 觀察IL-18對胰腺星狀細胞E-鈣黏素(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及趨化因子CX3CL1表達水平的影響。方法 人胰腺星狀細胞(PSCs)株HPaSteC常規培養、傳代，應用5、25、50、100 μg/L IL-18干預72 h，以未干預細胞為對照組。收集各組細胞，采用RT-PCR和蛋白質印跡法檢測細胞E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA及蛋白表達量。結果 對照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預組PSCs的E-cadherin mRNA表達量分別為1.03±0.17、0.77±0.15、0.89±0.12、0.54±0.11、0.46±0.06；α-SMA mRNA表達量為1.03±0.19、0.85±0.14、1.33±0.22、1.60±0.14、1.94±0.09；CX3CL1 mRNA表達量為1.01±0.08、0.88±0.25、0.86±0.17、1.58±0.26、1.83±0.13。干預組E-cadherin mRNA的表達下調，α-SMA及CX3CL1mRNA表達上調，其中100 μg/L干預組與對照組的差異均有統計學意義(P<0.05或<0.01)。對照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預組PSCs的E-cadherin蛋白表達量分別為1.00±0.14、1.14±0.04、1.14±0.07、0.85±0.08、0.80±0.06；α-SMA蛋白表達量為1.00±0.02、0.77±0.07、1.29±0.02、1.59±0.07、1.70±0.02；CX3CL1蛋白表達量分別為1.00±0.05、1.03±0.05、1.37±0.06、1.46±0.18、1.45±0.12。干預組E-cadherin蛋白表達下調，但各組間的差異無統計學意義；α-SMA蛋白表達上調，25、50、100 μg/L IL-18干預組與對照組的差異有統計學意義(P值均<0.01)；CX3CL1蛋白表達上調，其中100 μg/L干預組與對照組的差異有統計學意義(P<0.05)。結論 IL-18能激活人PSCs并上調PSCs趨化因子CX3CL1的表達。

胰腺； 星形細胞； 胰腺炎，慢性； 趨化因子CX3CL1； 白細胞介素18

Fund program：Youth Science Foundation，National Natural Science Foundation of China(81300352)

胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells，PSCs)不僅能分泌多種炎性因子和趨化因子參與炎性過程，而且能分泌膠原，在組織再生和纖維化中發揮關鍵作用[1]。PSCs一般處于靜息狀態，不表達α-平滑肌肌蛋白(α-SMA)，但被激活后α-SMA表達增加[2]。PSCs的激活是胰腺發生纖維化的主要原因。趨化因子CX3CL1在急性胰腺炎(AP)及慢性胰腺炎(CP)中發揮重要作用。研究發現，急性壞死性胰腺炎大鼠及CP患者的血清CX3CL1水平升高[3]。飲酒的CP患者血清CX3CL1水平升高更顯著，因酒精協同刺激PSCs分泌CX3CL1[4]，提示血清CX3CL1水平升高可能具有致病作用。IL-18是IL-1家族的細胞因子，有免疫反應調節作用[5]。IL-18作用于Th1細胞，刺激干擾素-γ和其他細胞因子的產生，可能通過激活PSCs和上調趨化因子CX3CL1表達參與CP的胰腺纖維化過程。本研究應用不同濃度IL-18干預PSCs，觀察E-鈣黏素(E-cadherin)、α-SMA、CX3CL1 mRNA和蛋白表達量的變化，探討IL-18的作用機制。

材料與方法

一、IL-18干預人PSCs

人PSCs株HPaSteC購自Science Cell公司，常規培養、傳代。取對數生長期細胞接種于6孔板，每孔5×105個細胞。培養至細胞融合度達80%后在各孔中分別加入終濃度為5、25、50、100 μg/L的IL-18(Biovision公司)，以未干預細胞作為對照組，孵育72 h后收集細胞。

二、E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA表達量的檢測

收集IL-18干預72 h的細胞，用TRIzol(Invitrogen公司)提取細胞總RNA，采用RT試劑盒(Fermentas公司)逆轉錄成cDNA，采用實時PCR法檢測各組細胞E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA表達量，按試劑盒說明書進行操作。E-cadherin正義序列5′-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3′，反義序列5′-TCCCAGGCGTAGACCAAGA-3′，擴增產物109 bp；α-SMA正義序列5′-CTGCTGAGCGTGAGATTGTC-3′，反義序列5′-TCAAGGGAGGATGAGGATGC-3′，擴增產物103 bp；CX3CL1(FKN)正義序列5′-ACCACGGTGTGACGAAATG-3′，反義序列5′-TGTTGATAGTGGATGAGCAAAGC-3′，擴增產物82 bp；內參GAPDH正義序列5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反義序列5′-GCCATCACGCCACAGTTC-3′，擴增產物101 bp。引物由華大基因設計并合成。PCR反應條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s，30個循環。用illumina eco實時熒光定量PCR儀自帶軟件獲得Ct值，以對照組細胞的表達量為1，采用公式2-△△Ct計算IL-18干預組細胞 E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

三、E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白表達量的檢測

收集上述各組細胞，常規提取總蛋白，BCA 法定量蛋白后行蛋白質印跡法檢測E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白表達量，以Tubulin為內參。小鼠抗人E-cadherin一抗購自Proteintech公司，工作濃度1∶8 000；小鼠抗人α-SMA一抗購自Abcam公司，工作濃度1∶300；小鼠抗人CX3CL1一抗購自Proteintech公司，工作濃度1∶500；小鼠抗人Tubulin購自Sigma公司，工作濃度1∶5 000；HRP標記羊抗小鼠二抗、HRP標記兔抗羊二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，工作濃度1∶50 000。ECL底物液購自Thermo公司。應用Image J軟件進行條帶掃描，以目的條帶與內參條帶灰度值比表示蛋白相對表達量。

四、統計學處理

結 果

一、各組E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA表達量

對照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預組PSCs的E-cadherin mRNA表達量分別為1.03±0.17、0.77±0.15、0.89±0.12、0.54±0.11、0.46±0.06，呈濃度依賴性下降趨勢，其中100 μg/L干預組與對照組的差異有統計學意義(t=3.08，P<0.05)。

對照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預組PSCs 的α-SMA mRNA表達量分別為1.03±0.19、0.85±0.14、1.33±0.22、1.60±0.14、1.94±0.09，呈濃度依賴性升高趨勢，其中100 μg/L干預組與對照組的差異有統計學意義(t=4.27，P<0.05)。

對照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預組PSCs 的CX3CL1 mRNA表達量分別為1.01±0.08、0.88±0.25、0.86±0.17、1.58±0.26、1.83±0.13，5、25 μg/L IL-18干預組表達量低于對照組，50、100 μg/L干預組表達量高于對照組，其中100 μg/L干預組與對照組的差異有統計學意義(t=5.32，P<0.01)。

二、各組E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 蛋白表達量(圖1)

對照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預組PSCs 的E-cadherin 蛋白表達量分別為1.00±0.14、1.14±0.04、1.14±0.07、0.85±0.08、0.80±0.06，呈濃度依賴性下降趨勢，但各組間的差異無統計學意義。

圖1 對照組(1)及5、25、50、100 μg/L IL-18干預組(2、3、4、5)PSCs的E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白表達

對照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預組PSCs的α-SMA蛋白表達量分別為1.00±0.02、0.77±0.07、1.29±0.02、1.59±0.07、1.70±0.02，呈濃度依賴性升高趨勢，25、50、100 μg/L IL-18干預組與對照間差異有統計學意義(t值分別為9.90、7.88、26.84，P值均<0.01)。

對照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預組PSCs的CX3CL1蛋白表達量分別為1.00±0.05、1.03±0.05，1.37±0.06、1.46±0.18、1.45±0.12，呈濃度依賴性升高趨勢，其中100 μg/L干預組與對照組的差異有統計學意義(t=3.40，P<0.05)。

討 論

目前為止，人們對于CP發病機制的了解還處于探索階段。趨化因子CX3CL1是CX3C家族獨特成員,是一種具有黏附功能的炎性趨化因子，它參與腎臟纖維化的病理生理過程[6]。本課題組曾報道[7]，CP大鼠的胰腺腺泡細胞、胰腺導管上皮細胞、炎癥細胞、胰島細胞及α-SMA陽性的活化PSCs均高表達IL-18和CX3CL1，提示IL-18和CX3CL1可能參與CP的纖維化進程。田軼倫和姜德謙[8]應用25、50、100 μg/L IL-18干預人臍靜脈內皮細胞，結果顯示IL-18能夠上調CX3CL1的表達并增強內皮細胞的趨化作用。Schneider等[9]報道，CP患者血清IL-18水平顯著升高。王麗敏等[10]報道，IL-18可能通過上調CX3CL1的表達增強其趨化作用來參與炎性反應。PSCs激活后CX3CL1表達增加，進一步促進胰腺纖維化形成。

本研究結果顯示，100 μg/L IL-18干預能夠促進α-SMA mRNA和蛋白表達增加，刺激PSCs激活；同時上調PSCs的CX3CL1表達，參與胰腺纖維化進程。關于CX3CL1表達上調機制的研究，目前相對較少。Uchida1等[5]報道，酒精通過激活PSCs的細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和解聯蛋白-金屬蛋白酶結構域17(a disintegrin and metalloprotease domain，ADAM17)，協同刺激PSCs釋放CX3CL1，ERK/ MAPK參與CX3CL1基因轉錄和產物分泌，但也存在其他因素參與的可能，如NF-κB或者干擾素調節因子[5]。關于PSCs激活后CX3CL1表達上調機制還有待更多研究。

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[2] Phillips PA, McCarroll JA, Park S, et al. Rat pancreatic stellate cells secrete matrix metalloproteinases: implications for extracellular matrix turnover[J]. Gut, 2003,52(2):275-282.

[3] Huang LY, Chen P, Xu LX, et al. Fractalkine as a marker for assessment of severe acute pancreatitis[J]. J Dig Dis, 2012,13(4):225-231.DOI: 10.1111/j.1751-2980.2012.00580.x.

[4] Uchida M, Ito T, Nakamura T, et al. ERK pathway and sheddases play an essential role in ethanol-induced CX3CL1 release in pancreatic stellate cells[J]. Lab Invest, 2013,93(1):41-53.DOI:10.1038/labinvest.2012.156.

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[7] 陳浩宇, 王茜, 陳潔. IL-18及趨化因子CX3CL1在慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化中的表達及其意義[J]. 中華胰腺病雜志, 2016,16:115-118.DOI:10.3760/cma.j.issn.1647-1935.2016.02.009.

[8] 田軼倫, 姜德謙. 白細胞介素-18對Fractalkine表達和趨化作用的影響[J]. 實用預防醫學, 2009,16:672-675.

[9] Schneider A, Haas SL, Hildenbrand R, et al. Enhanced expression of interleukin-18 in serum and pancreas of patients with chronic pancreatitis[J]. World J Gastroenterol, 2006,12(40):6507-6514.

[10] 王麗敏, 李春玉, 張佳濱,等.分形素趨化因子在腎臟纖維化大鼠腎組織中的表達及IL-18結合蛋白對其表達的影響[J]. 中國當代兒科雜志, 2013,15:1134-1138.DOI:10.7499/j.issn.1008-8830.2013.12.024.

(本文編輯：屠振興)

The influence of IL-18 on pancreatic stellate cells and CX3CL1 expression

WangQian,ChenHaoyu,ChenJie.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Objective To evaluate the effect of IL-18 on the expression of E-cadherin, α-SMA and CX3CL1 in pancreatic stellate cells(PSCs). Methods The human PSC line HPaSteC was routinely cultured and passaged. Five, 25, 50 and 100 μg/L IL-18 was used to treat PSCs for 72 h and the untreated PSCs were used as control. Treated and untreated cells were both collected, and RT-PCR and Western blot were used to detect mRNA and protein expression of E-cadherin, α-SMA and CX3CL1 respectively. Results The mRNA expressions of E-cadherin in control group and 5, 25, 50 and 100 μg/L IL-18 treated group were 1.03±0.17, 0.77±0.15, 0.89±0.12, 0.54±0.11 and 0.46±0.06. The mRNA expression of α-SMA were 1.03±0.19, 0.85±0.14, 1.33±0.22, 1.60±0.14 and 1.94±0.09；The mRNA expression of CX3CL1 were 1.01±0.08, 0.88±0.25, 0.86±0.17, 1.58±0.26 and 1.83±0.13. The mRNA expression of E-cadherin in IL-18 treated group were down-regulated , while the mRNA expression of α-SMA and CX3CL1 were up-regulated, and the differences between control and IL-18 100 μg/L treated group were statistically significant (P<0.05 or <0.01). The protein expression of E-cadherin in control group and 5, 25, 50 and 100 μg/L IL-18 treated group were 1.00±0.14，1.14±0.04, 1.14±0.07, 0.85±0.08 and 0.80±0.06. The protein expression of α-SMA were 1.00±0.02, 0.77±0.07, 1.29±0.02, 1.59±0.07 and 1.70±0.02；The protein expression of CX3CL1 were 1.00±0.05, 1.03±0.05, 1.37±0.06, 1.46±0.18 and 1.45±0.12. The protein expression of E-cadherin was down-regulated but no significant differences were observed among different groups. The protein expression of α-SMA was up-regulated and the differences between control group and 25, 50 and 100 μg/L IL-18 treated groups were statistically significant (allP<0.01). The protein expression of CX3CL1 was up-regulated and the differences between control group and 100 ng/ml IL-18 treated group were statistically significant (P<0.05). Conclusions IL-18 can activate PSCs and up-regulate the expression of chemokine CX3CL1.

Pancreas; Astrocytes; Panceatitis, chronic; Chemokine CX3CL1; Interleukin-18

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.01.008

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

陳潔，Email: jiechen0115@sohu.com

國家自然基金青年科學基金項目(81300352)

2016-09-19)