PHH3在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達(dá)及其意義

韓換 蔣慧 鄭建明

·論著·

PHH3在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達(dá)及其意義

韓換 蔣慧 鄭建明

目的 檢測(cè)磷酸化組蛋白H3(PHH3)在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(PNENs)中的表達(dá)，探討其對(duì)PNENs病理分級(jí)的意義。方法 回顧性分析2000年12月至2016年5月長(zhǎng)海醫(yī)院收治的283例PNENs患者的臨床病理資料，將所有PNENs組織制成組織芯片，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PHH3、Ki67的表達(dá)。通過(guò)繪制PHH3的受試者工作特征曲線，計(jì)算曲線下面積，確定PHH3對(duì)PNENs分級(jí)的臨界值。同時(shí)按國(guó)內(nèi)外公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Ki67對(duì)PNENs進(jìn)行分級(jí)。分析并比較PHH3、Ki67兩種分級(jí)方法與PNENs臨床病理特征、預(yù)后及兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果 本研究共納入PNENs患者283例，其中男性132例，女性151例，年齡16～78歲，平均(50±1)歲；功能性PNENs 44例，無(wú)功能性PNENs 239例；腫瘤直徑1.1～17 cm，平均(4.1±1.2)cm。PHH3法將283例患者分為G1級(jí)118例，G2級(jí)119例，胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(PNET)G3級(jí)38例，胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌(PNEC)G3級(jí)8例；Ki67法分為G1級(jí)127例，G2級(jí)116例，PNET G3級(jí)33例，PNEC G3級(jí)7例。兩種分級(jí)方法呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.941，P<0.001)。PHH3表達(dá)及PNENs分級(jí)均與患者的年齡、性別及腫瘤有無(wú)功能、腫瘤部位無(wú)相關(guān)性(P值均>0.05)，而與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及患者預(yù)后呈正相關(guān)(P值均<0.05)。每例組織芯片免疫組織化學(xué)染色后觀察PHH3的平均時(shí)間為9 min，觀察Ki67的平均時(shí)間為45 min。結(jié)論 檢測(cè)PNENs的PHH3表達(dá)可對(duì)PNENs進(jìn)行病理診斷分級(jí)和預(yù)后評(píng)估，較Ki67分級(jí)法更準(zhǔn)確和更便捷。

胰腺腫瘤； 神經(jīng)內(nèi)分泌瘤； PHH3； 免疫組織化學(xué)

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms, PNENs)是起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的異質(zhì)性腫瘤[1]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于PNENs的病理診斷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)2010版WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)指南[2]和2013版中國(guó)胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理診斷共識(shí)[3]。其中細(xì)胞增殖活性抗原Ki67是PNENs病理診斷分級(jí)的主要標(biāo)志物，但存在計(jì)算方法繁雜、耗時(shí)、準(zhǔn)確度低等缺點(diǎn)，因此迫切需要尋找方便、有效的新指標(biāo)。磷酸化組蛋白 H3(phospho-histone H3，PHH3)是真核細(xì)胞染色質(zhì)的主要構(gòu)成蛋白之一，在有絲分裂期(M期)表達(dá)水平最高，是一種特異性核分裂標(biāo)志物[4-5]。在擠壓變形組織中，PHH3可有效區(qū)別核碎裂或凋亡細(xì)胞。本研究采用組織芯片和免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)PNENs的PHH3、Ki67表達(dá)，分析并比較它們與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，探討PHH3作為PNENs病理診斷分級(jí)指標(biāo)的可行性。

資料與方法

一、臨床資料

收集2000年12月至2016年5月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院收治的PNENs患者臨床病理資料，診斷符合上述WHO分類(lèi)和國(guó)內(nèi)共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次診斷為PNENs；(2)術(shù)前未經(jīng)其他方式治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)混合性腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌(mixed adenoneuroendocrine carcinoma,MANEC)；(2)合并胰腺導(dǎo)管腺癌及其他類(lèi)型腫瘤；(3)隨訪時(shí)間不足4個(gè)月者；(4)術(shù)前1周至術(shù)后1周內(nèi)圍手術(shù)期死亡者。所有病例均由兩位高年資病理醫(yī)師重新復(fù)片、診斷分級(jí)，同時(shí)根據(jù)腫瘤是否具有激素分泌功能和有無(wú)出現(xiàn)激素引起的臨床癥狀，將PNENs分為功能性和無(wú)功能性。

二、觀察細(xì)胞核分裂象

觀察核分裂象(mitotic figure，MF)的方法：(1)多在腫瘤近表部取組織塊，因近表部腫瘤新生能力強(qiáng)；(2)勿在切片的出血、壞死邊緣，血管內(nèi)皮細(xì)胞，淋巴濾泡生發(fā)中心等區(qū)域計(jì)數(shù)MF；(3)選取細(xì)胞染色清晰，無(wú)刀痕區(qū)域，采取一字回紋或上下螺紋式法觀察。選取10個(gè)高倍視野(high power field，HPF)對(duì)MF計(jì)總數(shù)。

三、Ki67、PHH3蛋白的表達(dá)檢測(cè)

取283例石蠟包埋的腫瘤組織標(biāo)本，采用手工方法在組織芯片制作儀(韓國(guó)UNITMA公司)上制作組織芯片。首先在免疫組織化學(xué)切片上標(biāo)記Ki67陽(yáng)性點(diǎn)，然后在相對(duì)應(yīng)的蠟塊上取樣，取樣直徑均2 mm，每個(gè)蠟塊取樣3個(gè)點(diǎn)，組織芯片間距1.5 mm。

采用免疫組織化學(xué)染色SP法在組織芯片上檢測(cè)Ki67、PHH3蛋白表達(dá)。濃縮型兔抗人PHH3單克隆抗體購(gòu)自福州邁新公司，工作濃度1∶50；濃縮型兔抗人Ki67單克隆抗體購(gòu)自上海杰浩生物公司，工作濃度1∶100；即用型HRP標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗購(gòu)自上海杰浩生物公司。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性對(duì)照切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

胞核呈暗褐色或棕黃色顆粒狀著色為陽(yáng)性表達(dá)。在40倍高倍鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野(10HPF)的PHH3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取總數(shù)；在低倍鏡下取陽(yáng)性率最高的區(qū)域，計(jì)數(shù)500～2 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。PHH3、Ki67免疫組織芯片均由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立計(jì)數(shù)診斷。

四、隨訪

通過(guò)電話及門(mén)診問(wèn)詢(xún)方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2016年5月31日?？偵嫫?overall survival,OS)定義為腫瘤確診后至患者死亡或至隨訪截止仍存活的時(shí)間。無(wú)瘤生存期(disease-free survival,DFS)定義為腫瘤確診后至腫瘤復(fù)發(fā)或至隨訪截止仍未復(fù)發(fā)的時(shí)間。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。連續(xù)型變量若滿(mǎn)足正態(tài)分布和方差齊性，則采用t檢驗(yàn)，否則采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；分類(lèi)變量比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)；兩變量之間的相關(guān)性采用Spearmen等級(jí)相關(guān)分析。繪制PHH3受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線，計(jì)算曲線下面積(area under curve, AUC)，確定對(duì)PNENs分級(jí)的臨界值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床資料

本研究共納入PNENs患者283例，其中男性132例，女性151例，年齡16～78歲，平均(50±1)歲；功能性PNENs 44例，無(wú)功能性PNENs 239例；腫瘤直徑1.1～17 cm，平均(4.1±1.2)cm。

二、Ki67法的PNENs分級(jí)

每張組織芯片的免疫組織化學(xué)染色切片觀察Ki67平均耗時(shí)45 min。參考共識(shí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PNENs進(jìn)行分級(jí)，≤2%為G1級(jí)，3%～20%為G2級(jí)，21%～60%為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(PNET)G3級(jí)，>60%為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌(PNEC) G3級(jí)。本組G1級(jí)(圖1A)127例，G2級(jí)(圖1B)116例，PNET G3級(jí)33例，PNEC G3級(jí)7例。

圖1 Ki67分級(jí)的PNENs G1級(jí)(1A)和G2級(jí)(1B)(SP ×400)

三、PHH3法PNENs分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的確定

每張組織芯片的免疫組織化學(xué)染色切片觀察PHH3平均耗時(shí)9 min。PHH3的ROC曲線見(jiàn)圖2。依據(jù)約登指數(shù)(G1與G2最大值0.992、G2與PNET G3最大值0.982、PNET G3與PNEC G3最大值1)和AUC面積(G1與G2為0.991，G2與PNET G3為0.999，PNET G3與PNEC G3為1.000)，分別選取10HPF下5、29和70個(gè)核分裂象作為G1和G2期，G2和PNET G3期，PNET G3和PNEC G3期的臨界值。按此PHH3標(biāo)準(zhǔn)，本組G1級(jí)(圖2A)118例，G2級(jí)(圖2B)119例，PNET G3級(jí)38例，PNEC G3級(jí)8例。PHH3法PNENs分級(jí)與Ki67法的分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.941，P<0.001)。

圖2 PHH3的ROC曲線，G1與G2(2A)、G2與PNET G3(2B)、PNET G3與PNEC G3(2C)

圖3 PHH3分級(jí)的PNENs G1級(jí)(3A)和G2級(jí)(3B)(SP ×400)

四、PNENs組織PHH3、Ki67表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

PNENs組織PHH3、Ki67表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤有無(wú)功能、腫瘤部位均無(wú)相關(guān)性(P值均>0.05)，而與腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均呈正相關(guān)(P值均<0.05，表1)。

五、生存期分析

283例PNENs患者中34例(12%)失訪，249例(88%)獲得隨訪，隨訪時(shí)間為4～166個(gè)月，中位時(shí)間為42個(gè)月。PHH3、Ki67分級(jí)患者的術(shù)后OS及術(shù)后DFS曲線見(jiàn)圖4、5。PHH3、Ki67的PNENs分級(jí)均能夠很好地預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。

討 論

PNENs的發(fā)病率逐年升高，從1973至1977年的0.17/10萬(wàn)上升到2003至2007年的0.43/10萬(wàn)，其原因可能與對(duì)PNENs認(rèn)識(shí)的提高以及內(nèi)鏡和影像檢查技術(shù)的發(fā)展有關(guān)[6-7]。細(xì)胞增殖活性與PNENs的惡性程度密切相關(guān)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞增殖活性來(lái)劃分PNENs惡性程度已被國(guó)內(nèi)外廣泛接受，但是根據(jù)腫瘤增殖指數(shù)Ki67和核分裂象對(duì)PNENs分級(jí)有明顯的缺點(diǎn)：(1)計(jì)算復(fù)雜。核分裂象計(jì)數(shù)單位為2 mm2，相當(dāng)于20 mm目鏡的10個(gè)高倍鏡視野；若采用其他孔徑的目鏡，則需進(jìn)行相應(yīng)換算[8]，步驟繁復(fù)。(2)可重復(fù)性差。早期的核分裂象很難識(shí)別且易與凋亡小體、壞死細(xì)胞及核碎片相混淆[9-10]，因此醫(yī)師主觀因素對(duì)結(jié)果的影響較大。(3)計(jì)數(shù)耗時(shí)長(zhǎng)。需在鏡下500～2 000個(gè)細(xì)胞中數(shù)出其中Ki67陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)，并且要排除淋巴細(xì)胞和其他非腫瘤細(xì)胞，無(wú)論是手動(dòng)還是自動(dòng)計(jì)數(shù)，每個(gè)病例至少需要耗時(shí)15 min。(4)特異性不高。Ki67不僅能從M期的細(xì)胞檢出，也能從S、G1、G2期的細(xì)胞中檢出[11]，因此其不能真正反應(yīng)細(xì)胞的增殖指數(shù)。

表1 PHH3和Ki67在PNENs患者中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖4 PHH3分級(jí)的PNENs患者OS(4A)和DFS(4B)曲線 圖5 Ki67分級(jí)的PNENs患者OS(5A)和DFS(5B)曲線

1997年Hendzel等[12]首先提出PHH3作為核分裂的標(biāo)志物，此后關(guān)于PHH3的研究不斷增加。PHH3是新近發(fā)現(xiàn)的5個(gè)核心組蛋白之一，在真核細(xì)胞中與其他組蛋白共同構(gòu)成染色質(zhì)中主要的蛋白組分[13]。

本研究建立了PHH3法PNENs的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示PHH3法與Ki67法的分級(jí)呈正相關(guān)。兩種分級(jí)方法均顯示與患者的年齡、性別及腫瘤有無(wú)功能、腫瘤部位無(wú)相關(guān)性，而與腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)。兩種分級(jí)在G1、G2、PNET G3、PNEC G3級(jí)患者之間的預(yù)后差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用PHH3法分級(jí)的優(yōu)勢(shì)：(1)高分辨率和準(zhǔn)確率。特異性染色M期細(xì)胞的PHH3能夠消除在HE染色下含糊不清的核分裂計(jì)數(shù)，明顯區(qū)分核分裂象和凋亡小體，不同觀察者之間的差異性不大[14]。(2)高效省時(shí)。在低倍鏡下可很快找到PHH3 標(biāo)記的核分裂熱點(diǎn)區(qū)域，大大縮短計(jì)數(shù)核分裂的時(shí)間，平均每例只需耗時(shí)3 min。(3)判斷生物學(xué)行為。 PHH3特異性染色核分裂象能更加準(zhǔn)確地預(yù)示腫瘤生物學(xué)行為，現(xiàn)已經(jīng)用于評(píng)估腦膜瘤、星形細(xì)胞瘤、黑色素瘤、肺類(lèi)癌以及子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖活性[14-19]。因此，檢測(cè)PNENs組織中PHH3的表達(dá)對(duì)其病理診斷分級(jí)、臨床治療以及預(yù)后判斷具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值，但這一結(jié)果有待于更多研究中心的驗(yàn)證。

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(本文編輯：冀凱宏)

Expression and significance of PHH3 in pancreatic neuroendocrine neoplasms

HanHuan,JiangHui,ZhengJiangming.

DepartmentofPathology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ZhengJiangming,Email:Jmzheng1962@163.com

Objective To investigate the expression of phospho-histone H3(PHH3) protein in pancreatic neuroendocrine neoplasms (PNENs) and explore its potential value for pathological grading of PNENs. Methods Clinical and pathological data of 283 patients with PNENs treated in Changhai Hospital from December 2000 to May 2016 were retrospectively analyzed. PNENs tissue chip was prepared, and immunohistochemistry was used to examine the expression of PHH3 and Ki67. The receiver operating characteristic curve for PHH3 was drawn and the area under the curve(AUC) was calculated to determine the cutoff value for PNENs grading. Ki67 was used for PNENs grading according to domestic and international criteria for PNENs classification. The relationship of PHH3 and Ki67 classification with clinical pathological features and prognosis of PNENs as well as the correlation between the two classification methods were analyzed. Results Of 283 patients, 132 were male and 151 were female, aged from 16 to 78 years old. The average age was (50±1) years old. There were 44 cases with functional PNENs and 239 with non-functional PNENs. The diameter of tumors ranged from 1.1 cm to 17 cm and the average diameter was (4.1±1.2)cm. According to the Ki67 standard, there were 127, 116, 33 and 7 cases of Grade G1, G2, pancreatic neuroendocrine tumor(PNET) G3 and pancreatic neuroendocrine cancer(PNEC) G3. According to the PHH3 positive correlation between the two grading criteria (r=0.941,P<0.001). PHH3 expression and PNENs grading were not correlated with age, gender, tumor functional or not and tumor locations (allP>0.05), but were both positively correlated with tumor size, histological grade, lymph node metastasis, TNM stage and prognosis (allP<0.05). The average time of observing PHH3 and Ki67 staining per case in the immunohistochemistry of tissue chip was 9 min and 45 min, respectively. Conclusions Detection of PHH3 expression in PNENs can be used for the pathological diagnosis, grading and prognostic evaluation, which was more accurate and convenient than Ki67 criteria.

Pancreatic neoplasms； Neuroendocrine tumors; Phospho-histone H3； Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.01.005

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院病理科

鄭建明，Email: Jmzheng1962@163.com

2016-11-14)