阿帕替尼對胰腺癌細胞株AsPC-1增殖、遷移和凋亡的影響

顧曉霞 李潔 吳梅紅 彭小波 湛先保

·論著·

阿帕替尼對胰腺癌細胞株AsPC-1增殖、遷移和凋亡的影響

顧曉霞 李潔 吳梅紅 彭小波 湛先保

目的 探討阿帕替尼(Apatinib)對體外培養的胰腺癌AsPC-1細胞增殖、凋亡、遷移的影響。方法 以不同濃度Apatinib干預胰腺癌AsPC-1細胞，采用CCK-8法和流式細胞技術檢測細胞的增殖和凋亡，通過劃痕實驗觀察Apatinib對胰腺癌細胞遷移能力的影響。結果 對照組及10、20、30、40、50μmol/L Apatinib處理組AsPC-1細胞的增殖抑制率分別為0、(1.45±0.68)%、(16.92±0.70)%、(23.84±0.84)%、(34.35±1.55)%、(37.33±0.81)%，細胞增殖隨Apatinib濃度的增加而顯著被抑制，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組及20、40 μmol/L Apatinib處理組AsPC-1細胞的凋亡率分別為(9.44±0.18)%、(16.62±0.19)%、(25.42±0.41)%，細胞凋亡數量隨Apatinib濃度增加而顯著增多，差異具有統計學意義(P<0.05)。對照組及20、40 μmol/L Apatinib處理組AsPC-1細胞的遷移率分別為(29.5±0.7)%、(17.4±0.9)%、(6.6±0.5)%，細胞遷移能力隨Apatinib濃度增加而顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 Apatinib能有效抑制胰腺癌AsPC-1細胞的增殖、遷移，并誘導其凋亡。

阿帕替尼； 胰腺腫瘤； 細胞增殖； 細胞運動； 細胞凋亡

胰腺癌是高度惡性的腫瘤，5年生存率低于5%[1]，這主要與它早期局部或者遠處轉移、臨床癥狀出現較晚、對傳統的化療和放射治療高度抵抗等因素有關[2-3]。吉西他濱是目前用于局部進展和轉移性胰腺癌患者的標準化療藥物，但也只能延長患者幾周的生存期[4]。Apatinib是一種新的、通過口服給予的血管上皮生長因子受體-2(VEGFR-2)的選擇性抑制劑，可以有效抑制細胞內VEGFR-2的磷酸化,也能抑制c-Kit和c-Src的激酶活性以及c-Kit和血小板源生長因子受體(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)的磷酸化[5]。研究顯示[6-9]，Apatinib在體外能抑制多種腫瘤細胞，如非小細胞肺癌、乳腺癌、膽管細胞癌等的增殖，也能明顯減緩裸鼠移植瘤的生長，且毒性較小。但目前尚未見其對胰腺癌的研究報道。本研究應用Apatinib干預胰腺癌AsPC-1細胞，觀察其對癌細胞增殖、凋亡、遷移的影響。

材料和方法

一、CCK-8法測定細胞增殖抑制率

人胰腺癌AsPC-1細胞由上海長海醫院消化內科實驗室提供，常規復蘇、培養、傳代。取對數生長期細胞，調整細胞密度為5×104/ml，在96孔板每孔中加入100 μl細胞懸液，培養至細胞貼壁后更換含1% FBS的DMEM饑餓培養過夜，然后加入10、20、30、40、50 μmol/L的Apatinib，以不加Apatinib作為對照組，每組設6個復孔。培養24 h后每孔加入10 μl CCK-8液繼續培養2 h，上酶標儀測定450 nm處的吸光度值(A450值)，繪制細胞生長曲線。Apatinib由恒瑞醫藥有限公司提供，CCK-8試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司。

二、流式細胞技術檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞，以每孔5×105個AsPC-1細胞接種于6孔板，培養至細胞80%融合后饑餓培養過夜，然后加入20、40 μmol/L的Apatinib，以不加Apatinib作為對照組。培養24 h后用胰酶消化收集細胞，PBS清洗1次后重懸于300 μl PBS，加入300 μl的binding buffer、3μl AV-FITC和3 μl PI，混均后避光10 min，上流式細胞儀檢測細胞的凋亡比例。

三、細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取對數生長期細胞，以每孔5×105個AsPC-1細胞接種于6孔板，培養至細胞90%融合后饑餓培養過夜，用200 μl的移液槍頭在每孔中間劃一條橫線， PBS沖洗3次，然后加入20、40 μmol/L Apatinib，以不加Apatinib作為對照組。在培養即刻(0 h)及培養24 h時置顯微鏡下照相，每個樣本測量3個劃痕距離。細胞遷移率= [(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離]×100%。實驗重復3次，取均值。

四、統計學處理

結 果

一、Apatinib對AsPC-1細胞增殖的影響

對照組及10、20、30、40、50 μmol/L Apatinib處理組AsPC-1細胞的增殖抑制率分別為0、(1.45±0.68)%、(16.92±0.70)%、(23.84±0.84)%、(34.35±1.55)%、(37.33±0.81)%，細胞增殖隨Apatinib濃度的增加而顯著被抑制，差異有統計學意義(P<0.05)。

二、Apatinib對AsPC-1細胞凋亡的影響

對照組及20、40 μmol/L Apatinib處理組AsPC-1細胞培養24 h后的凋亡率分別為(9.44±0.18)%、(16.62±0.19)%、(25.42±0.41)%，細胞凋亡數量隨Apatinib濃度增加而顯著增多，差異具有統計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 對照組(1A)及20、40 μmol/L Apatinib處理組(1B、1C)AsPC-1細胞的凋亡

三、Apatinib 對AsPC-1細胞遷移能力的影響

對照組及20、40 μmol/L Apatinib處理組AsPC-1細胞培養24 h后的遷移率分別為(29.5±0.7)%、(17.4±0.9)%、(6.6±0.5)%，細胞遷移能力隨Apatinib濃度增加而顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

討 論

血管形成是腫瘤的標志之一，能夠促進惡性腫瘤的生長和轉移[10]，而腫瘤轉移是引起腫瘤相關死亡的主要原因。胰腺癌預后不良也和腫瘤轉移密切相關，大約50%的胰腺癌患者被確診時已有遠處轉移。促進腫瘤血管形成的通路主要有3條：VEGF/VEGFR、血管生成素(ANGPT)家族以及Notch-Notch配體通路，其中VEGF是血管形成的重要調節因子。VEGF通過和VEGFR-2結合發揮促血管生成的作用以及誘導VEGFR-2的下游分子的激活。VEGFR-2主要是在血管內皮細胞上表達的，在很多腫瘤表達都是上調的，包括胰腺癌[11]。VEGF和VEGFR的過表達與腫瘤生長速率加快、微血管密度增加、腫瘤增殖和轉移能力增強以及不良預后相關[12]。

圖2 對照組(2A)及20、40 μmol/L Apatinib處理組(2B、2C)AsPC-1細胞的遷移

近年來拮抗血管形成成為腫瘤治療的研究熱點之一，抗血管藥物在很多實體腫瘤，如肺癌、乳腺癌、結腸癌、胃癌等的治療中效果顯著，目前很多抗血管藥物也已用于胰腺癌患者，如貝伐單抗(抗VEGF的單克隆抗體)。貝伐單抗聯合吉西他濱用于晚期胰腺癌患者的Ⅱ期臨床研究顯示，聯合治療的總生存期、無進展生存期、客觀反應率均較單用吉西他濱有較明顯改善，但隨后的Ⅲ期研究結果顯示在總生存期方面并沒有明顯改善[13]。多種VEGF信號通路抑制劑，如sunitinib、axitinib、sorafenib、vatalanib等也已在晚期胰腺癌患者中開展Ⅱ或Ⅲ期臨床研究。Apatinib在胃癌的Ⅲ期以及非小細胞肺癌的Ⅱ期試驗中顯示有生存效益，且不良反應較少，在肺癌、乳腺癌患者中能明顯改善患者預后。Peng等[14]研究結果顯示，Apatinib通過VEGF/VEGFR-2/PI3K/AKT信號通路抑制肝內膽管癌細胞的增殖并誘導其凋亡。Doi等[15]也報道VEGF-A/VEGFR-2信號在多個胰腺癌細胞系的遷移和侵襲中起到了重要的作用。本研究結果顯示，Apatinib在體外可以抑制AsPC-1細胞的增殖、遷移并誘導其凋亡，且濃度越高，抑制作用越明顯。

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(本文編輯：屠振興)

Effect of apatinib on cell proliferation, migration and apoptosis in pancreatic cancer cell line AsPC-1

GuXiaoxia,LiJie,WuMeihong,PengXiaobo,ZhanXianbao.

DepartmentofOncology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ZhanXianbao,Email：zhanxianbao@126.com

Objective To investigate the effect of apatinib on the proliferation, apoptosis and migration of pancreatic cancer cell line AsPC-1 in vitro. Methods Pancreatic cancer AsPC-1 cells were treated by apatinib in different concentrations. Cell proliferation and apoptosis were measured by CCK-8 and flow cytometry, and the effect of apatinib on cell migration ability was observed by wound healing assay. Results In control and 10, 20, 30, 40 and 50umol/L apatinib treatment group, the inhibitory rates of AsPC-1 cells were 0,(1.45±0.68)%,(16.92±0.70)%,(23.84±0.84)%,(34.35±1.55)% and (37.33±0.81)%，respectively. Cell proliferation was obviously inhibited by apatinib as the concentration increased, and the differences were statistically significant (P<0.05). In control and 20, 40 umol/L apatinib treatment group, the apoptotic rates were (9.44±0.18)%,(16.62±0.19)% and (25.42±0.41)%, respectively. Number of apoptotic cells was obviously increased by apatinib as the concentration increased, and the differences were statistically significant (P<0.05). In control and 20, 40 umol/L apatinib treatment group, the migration ability was (29.5±0.7)% ,(17.4±0.9)% and (6.6±0.5)%, which was greatly decreased as the concentration increased, and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusions Apatinib can effectively inhibit the proliferation and migration of pancreatic cancer AsPC-1 cells and induce apoptosis.

Apatinib; Pancreatic neoplasms; Cell proliferation; Cell movement; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.01.004

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院腫瘤科

湛先保，Email: zhanxianbao@126.com

2016-11-13)