噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)概述

蔡盡忠

(福建省廈門(mén)華廈學(xué)院檢驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)系 361021)

20世紀(jì)80年代中期，Smith等[1]在絲狀噬菌體分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上提出了噬菌體展示技術(shù)(phage display technique)。1989年，英國(guó)Winter研究組和美國(guó)Lernard研究組同時(shí)創(chuàng)建了噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)(phage antibody library technique)。1990年，McCafferty[2]在絲狀噬菌體表面成功展示具有抗原結(jié)合能力的抗體片段，進(jìn)一步推動(dòng)了噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的研究。

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是利用PCR擴(kuò)增出抗體的全套可變區(qū)基因，利用噬菌體表面展示技術(shù)把Fab段或單鏈抗體(ScFv)表達(dá)在噬菌體表面，并進(jìn)一步通過(guò)“吸附—洗脫—擴(kuò)增”方法篩選和富集特異性抗體的技術(shù)[3]。這一技術(shù)將表型與基因型聯(lián)系在一起，將抗體識(shí)別抗原的能力與噬菌體擴(kuò)增的能力結(jié)合在一起，是一項(xiàng)極為高效的表達(dá)、篩選體系，在生物技術(shù)領(lǐng)域極具應(yīng)用前景[4]。本文綜述噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建原理、技術(shù)過(guò)程及應(yīng)用。

1 噬菌體抗體庫(kù)的技術(shù)原理

噬菌體展示技術(shù)是一種基因表達(dá)和篩選的技術(shù)，即將外源蛋白分子或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達(dá)，展示在噬菌體顆粒的表面[5]。這樣，外源蛋白或多肽的基因型與表型統(tǒng)一在同一噬菌體顆粒內(nèi)，通過(guò)表型篩選就可以獲得相應(yīng)的編碼基因。

雖有多種外殼蛋白被用于噬菌體展示，但目前文獻(xiàn)報(bào)道的用于抗體分子展示的主要是PⅢ蛋白和PⅧ蛋白[6]。PⅢ蛋白位于噬菌體顆粒的尾端，含有406個(gè)氨基酸殘基，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)噬菌體含有3～5個(gè)副本。3個(gè)結(jié)構(gòu)域由甘氨酸富集的連接肽串聯(lián)起來(lái)，在結(jié)構(gòu)上具有高度易變性和靈活性，故其N(xiāo)端可以插入較大的外源片段而不影響噬菌體的結(jié)構(gòu)和功能，而且融合表達(dá)的外源片段還可保持相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)構(gòu)象[7]。PⅧ蛋白是噬菌體的主要外殼蛋白，含有32個(gè)氨基酸殘基，每個(gè)噬菌體含有3～5個(gè)副本。其C端與噬菌體DNA結(jié)合，構(gòu)成噬菌體包膜的內(nèi)壁，N端游離在外，可容納較小的外源片段。

噬菌體展示的抗體是在噬菌體表面表達(dá)的抗體分子Fab或ScFv，這種表達(dá)是通過(guò)Fab或ScFv與載體即噬菌體外殼蛋白(PⅢ或PⅧ蛋白)形成融合蛋白而完成。其特點(diǎn)是噬菌體載體既可以識(shí)別相應(yīng)抗原并與之相結(jié)合，又能夠感染宿主菌而進(jìn)行再擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)相應(yīng)融合蛋白的擴(kuò)增，再經(jīng)過(guò)“吸附—洗脫—擴(kuò)增”過(guò)程就能篩選并富集特異性抗體。將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來(lái)，組成噬菌體抗體的群體，就成為了噬菌體抗體庫(kù)[8]，而建立噬菌體抗體庫(kù)的全套方法便被稱(chēng)為噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)。它的最大特點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了直接將基因型和表型聯(lián)系在一起，可以快速而高效地從大量克隆中篩選出特異性抗體。根據(jù)抗體基因的來(lái)源和組成不同，噬菌體抗體庫(kù)可分為天然抗體庫(kù)、免疫抗體庫(kù)、半合成抗體庫(kù)和轉(zhuǎn)基因鼠抗體庫(kù)。

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的產(chǎn)生依賴(lài)于三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展：一是簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)成功及從雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出全套抗體可變區(qū)基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)的創(chuàng)建；二是從大腸桿菌分泌有結(jié)合功能的免疫球蛋白分子片段的成功；三是噬菌體表面展示技術(shù)的建立。

應(yīng)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)制備抗體的優(yōu)勢(shì)在于：①方法簡(jiǎn)單快速高效，不經(jīng)過(guò)雜交瘤技術(shù)和不需復(fù)雜的基因工程技術(shù)，制備一株抗體僅需幾周時(shí)間；②抗體篩選范圍廣，可對(duì)百萬(wàn)至億萬(wàn)個(gè)分子進(jìn)行選擇；③用不同的抗原進(jìn)行篩選，可同時(shí)獲得幾種不同的抗體。

2 噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程

構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)主要可以分為以下3個(gè)步驟：

2.1 擴(kuò)增全套抗體基因 獲取已經(jīng)過(guò)免疫的人外周血淋巴、脾、扁桃腺、淋巴結(jié)組織或骨髓細(xì)胞，從中提取總RNA或基因組DNA。理論上每個(gè)靜止期B細(xì)胞可產(chǎn)生100個(gè)拷貝的Ig mRNA，而增殖期的漿細(xì)胞可產(chǎn)生300個(gè)。因此，免疫接種可明顯提高Ig mRNA和編碼抗原結(jié)合部位V區(qū)基因的數(shù)量。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)擴(kuò)增技術(shù)獲得建庫(kù)所需的全套抗體基因[9～12]。

抗體基因擴(kuò)增的5′端引物的設(shè)計(jì)通常是根據(jù)成熟抗體V區(qū)外顯子的框架1區(qū)(FR1)或前導(dǎo)區(qū)的保守序列，而3′端引物的設(shè)計(jì)則主要依據(jù)抗體絞鏈區(qū)(J區(qū))的保守序列。根據(jù)已有的抗體庫(kù)基因序列庫(kù)(Kabat database， V-base， IMGT等)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。分別對(duì)抗體 cDNA或DNA擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物予以混合。若制備ScFv抗體基因片段，須設(shè)計(jì)接頭(linkers)DNA，如[Gly4-Ser]3的編碼寡核苷酸，制備VH-linker-VL基因連接物，進(jìn)行下一步的基因克隆與表達(dá)[13，14]。

2.2 構(gòu)建合適的噬菌體表面展示載體 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)使用的載體是在已有的噬菌?；A(chǔ)上改建的。這些載體都具備必需的元件, 包括啟動(dòng)子、大腸桿菌前導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合部位、供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)以及絲狀噬菌體M13的外殼蛋白基因。pcomb3是一個(gè)經(jīng)常用于噬菌體建庫(kù)的載體，它除了保留原載體中的前導(dǎo)序列及供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)外，還引入來(lái)自M13噬菌體LacZ啟動(dòng)子、操縱子及用于控制輕鏈基因的帽子結(jié)合位點(diǎn)等。對(duì)其進(jìn)一步拼接編碼M13噬菌體外殼蛋白的gⅢ基因，并在克隆位點(diǎn)上加入來(lái)自于pbluescript的填充片段便構(gòu)成了4029 bp的pcomb3。使用載體構(gòu)建抗體基因庫(kù)時(shí)，可將獲得的全套重鏈和輕鏈基因以適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶消化后，克隆進(jìn)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)隨機(jī)重排組合將這些基因插入到噬菌體或噬菌粒表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)中。經(jīng)克隆進(jìn)入載體的重、輕鏈基因間的配對(duì)也存在著很大的隨機(jī)性，這可以豐富抗體庫(kù)的內(nèi)涵，增加抗體庫(kù)的多樣性。

2.3 將抗體基因庫(kù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌備用 在建庫(kù)過(guò)程中由于PCR擴(kuò)增，半合成寡核苷酸的引入以及多步酶學(xué)反應(yīng)等因素產(chǎn)生的重復(fù)克隆、無(wú)效克隆及克隆數(shù)丟失，使庫(kù)容量偏小。因此，噬菌體抗體庫(kù)的大小與大腸桿菌轉(zhuǎn)化率明顯相關(guān)。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高限制性?xún)?nèi)切酶的酶切與連接效率；選擇合適的載體與目的基因的比例；選用轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞，能提高單次連接和轉(zhuǎn)化的效率。再通過(guò)增加連接與轉(zhuǎn)化的次數(shù)，就能使400 μL感受態(tài)的大腸桿菌經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化，至少有108個(gè)細(xì)胞可被噬菌粒載體轉(zhuǎn)染。這與體內(nèi)抗體庫(kù)獨(dú)特型數(shù)目一致。如果噬菌粒在體外包裝后則還可以明顯增加轉(zhuǎn)染大腸桿菌的數(shù)量。因此，電穿孔是一種理想而有效的增加大腸桿菌抗體庫(kù)數(shù)量的手段。

3 噬菌體抗體庫(kù)的篩選

噬菌體抗體庫(kù)的篩選包括淘篩和鑒定。淘篩(panning)是指噬菌體抗體庫(kù)與選擇的抗原共同孵育，通過(guò)幾輪洗脫中斷噬菌體-抗原反應(yīng)(不影響噬菌體的感染能力)，棄去未結(jié)合的噬菌體，收集結(jié)合的噬菌體。具體的步驟：①噬菌體吸附靶抗原；②反復(fù)洗滌去除非特異性結(jié)合；③洗脫并收集與抗原結(jié)合的噬菌體；④再次感染大腸桿菌，使特異的噬菌體抗體淘篩。經(jīng)過(guò)一輪這樣的“吸附—洗脫—擴(kuò)增”的淘篩，可使特異性抗體的噬菌體富集20～1000倍。若每一輪淘篩按50倍的富集率計(jì)算，經(jīng)過(guò)4輪淘篩，可使噬菌體抗體的富集率達(dá)108以上，篩選出占庫(kù)容量?jī)H為1/108的噬菌體抗體，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)借助這種高效篩選系統(tǒng)，能夠方便地對(duì)庫(kù)容量在108以上的抗體進(jìn)行篩選。這種極強(qiáng)的篩選能力是早期的抗體庫(kù)技術(shù)所望塵莫及的[15～17]。

目前，已經(jīng)根據(jù)篩選的不同要求發(fā)展出了多種篩選方法，包括：固相淘篩(將抗原固定于免疫管或制成親和柱進(jìn)行免疫淘選)、捕獲淘篩(將靶抗原特異的單抗或多抗固定于固相表面，隨后加入靶抗原進(jìn)行淘選)、完整細(xì)胞淘篩(用完整細(xì)胞對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行淘選)、組織淘篩和器官淘篩等。這些方法均有成功的報(bào)道，為噬菌體抗體的淘篩增添了新的途徑。

要獲得高親和力的噬菌體抗體，抗體庫(kù)的篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在篩選過(guò)程中，噬菌體種類(lèi)、固相介質(zhì)表面的抗原密度或溶液中抗原的濃度和清洗時(shí)間三種因素對(duì)篩選的效率影響較大。當(dāng)篩選較小的抗體庫(kù)(107～108克隆)時(shí)，在前幾輪采用中等的嚴(yán)緊度有利于避免高親和力低表達(dá)克隆的丟失，而較大的抗體庫(kù)則可采用較高嚴(yán)緊度以較快地富集親和性克隆。

4 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的應(yīng)用

近年來(lái)，噬菌體抗體庫(kù)已成為基因工程抗體研究的熱點(diǎn)之一，并被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)已經(jīng)獲得了大量針對(duì)病原微生物的抗體，如甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、風(fēng)疹病毒、流感嗜血桿菌、破傷風(fēng)毒素以及嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)病毒等[18～21]。這些噬菌體抗體中，許多具有臨床診斷和治療的應(yīng)用前景。以抗體庫(kù)技術(shù)為工具，了解機(jī)體受病原微生物感染時(shí)所激發(fā)的體液免疫反應(yīng)格局，為疫苗設(shè)計(jì)和發(fā)病機(jī)制的研究提供依據(jù)。

來(lái)源于病人的噬菌體抗體，在基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)上真實(shí)地反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。利用這類(lèi)單抗可以分析自身抗原的表位結(jié)構(gòu)；以人自身抗體為探針?lè)治鲎陨砻庖呒膊』颊哐逯凶陨砜贵w的“表位指紋”，有助于了解B細(xì)胞表位和疾病表現(xiàn)之間的關(guān)系。通過(guò)分析自身抗體可變區(qū)的編碼基因，能夠了解此類(lèi)抗體的基因取用規(guī)律。利用腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原篩選噬菌體抗體庫(kù)，能夠得到特異性人單抗。將其接在腫瘤壞死因子和其他淋巴因子上，用于腫瘤的免疫治療，增強(qiáng)抗腫瘤活性；而將其接上同位素則可用于腫瘤顯像分析[22]。

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)與單抗技術(shù)相比，其優(yōu)勢(shì)在于能夠制備人單抗，從而避免了鼠單抗應(yīng)用于人體時(shí)而引發(fā)的免疫反應(yīng)。而且，通過(guò)體外親和力成熟技術(shù)和動(dòng)力學(xué)常數(shù)篩選技術(shù)，能夠?qū)τ嘘P(guān)抗體進(jìn)行改造，從中得到特異性和動(dòng)力學(xué)特性均較好的抗體。

5 結(jié)語(yǔ)

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是抗體工程發(fā)展進(jìn)程的一個(gè)里程碑。經(jīng)過(guò)不斷努力，目前噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)已經(jīng)比較成熟，并已經(jīng)在世界范圍內(nèi)推廣和應(yīng)用，在分子生物學(xué)、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域產(chǎn)生了廣泛的影響。

但是此技術(shù)目前還有許多問(wèn)題尚待解決。例如，如何實(shí)現(xiàn)抗體的全分子表達(dá)，如何獲得庫(kù)容量大、特異性高、敏感性強(qiáng)的抗體庫(kù)以及如何提高抗體的產(chǎn)量等。可以相信，隨著各種優(yōu)化方法的建立，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)將為治愈某些嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病帶來(lái)希望。