格里菲斯肺炎雙球菌轉化實驗的細胞機制

王 妍 沈 帆

(南京師范大學教師教育學院 210009)

李建宏*

(南京師范大學生命科學學院 210046)

1 肺炎雙球菌

肺炎雙球菌(Streptococcuspneumoniae)是革蘭氏陽性菌，屬鏈球菌科鏈球菌屬，是兼性厭氧鏈球菌。在19世紀末期，肺炎雙球菌被認定為是導致肺炎的一大原因，是許多體液免疫研究的主題。肺炎雙球菌可無癥狀駐留在健康帶菌者的鼻咽部、呼吸道，鼻竇和鼻腔是通常被感染的部分。然而，對于易感人群(如免疫力低下的老年人和兒童)，它們有可能成為致病性因素[1]。它們擁有的多糖莢膜充當著生物體毒力因子，根據莢膜多糖抗原的不同，可將其分為90多種不同的血清型，不同的類型毒力、發病率和耐藥性的程度不同[2]。

根據肺炎雙球菌的菌落特征，肺炎雙球菌分為兩種類型：光滑型(S)和粗糙型(R)。S型細菌的菌體是有莢膜的，通常有毒性，而R型細菌無莢膜，無毒性。這里所說的毒性并不是說莢膜有毒性，莢膜只是細菌細胞壁外的一層較松厚且較固定的粘性物質，主要由水、多糖或多肽組成[3]。這層莢膜，可作為S型菌的保護層，在侵染的生物體內，可以抵抗吞噬細胞的吞噬和消化作用，從而能夠迅速繁殖、擴散，引起機體發生疾病。而R型菌無莢膜，可被吞噬細胞吞噬，不會導致機體患病。所以細菌是否致病，關鍵是看有無莢膜。

2 肺炎雙球菌的轉化過程

1928年格里菲斯用肺炎雙球菌在小鼠身上進行了轉化實驗。對于實驗產生的現象，格里菲斯認為：S型死菌細胞中有某種物質進入R型活菌細胞，從而使R型菌轉化為S型菌。后來艾弗里等人用生物化學方法明確這種物質是DNA。

那么S型菌的哪段DNA進入R型菌了呢？盡管肺炎雙球菌的種類很多，但經過測序發現莢膜基因的位點幾乎都位于染色體上的dexB基因與aliA基因之間[4]。在dexB和aliA基因之間，包含編碼莢膜合成的相關基因，包括多糖的合成、轉運、與脂質載體連接等過程所需要酶的基因，形成的莢膜可以保護肺炎鏈球菌逃避補體介導的中性粒細胞的吞噬作用，有助于細菌在宿主中存活。由此可以確定，格里菲斯實驗中轉入R型菌的是S型菌染色體上的帶有莢膜基因的DNA片段。

在肺炎球菌轉化過程中，外部的DNA片段是怎么進入R型菌的呢？這其實是一個細菌的自然轉化過程——具備自然轉化能力的細胞可以自發地從外界獲取DNA，其中具備攝取外源DNA能力的細胞被稱為感受態細胞。這個轉化的過程大致分為三步：首先，R型菌成為感受態細胞，接著感受態細胞攝取外源DNA，最后外源DNA在該細胞中進行同源重組。

2.1 R型菌成為感受態細胞 成為感受態細胞是攝取外源DNA的前提。肺炎雙球菌感受態的調控主要涉及五個蛋白(ComABCDE)，它們共同組成一個群體感應系統。ComC編碼感受態信息素(CSP)前體，當細胞外CSP積累到可以發生感受態臨階濃度時，與膜結合蛋白ComD結合使其磷酸化，當磷酸基團轉移到ComE上，它被激活并刺激大約20個早期感受基因轉錄，包括編碼ComABCDE的基因、sigma因子ComX和免疫蛋白ComM。ComABCDE表達的增加，形成了一個自動催化回路，使細胞進入感受態[5]。

2.2 攝取外源DNA 由于高溫加熱S菌，使其死亡，所以細胞破裂，細胞內的DNA被釋放出來。此時，R型菌感受態細胞產生轉化菌毛，它可以結合雙鏈DNA，從而使其穿過R菌的細胞壁和細胞膜[6]。當然這只是一種假設，還需要更多的證據來證明。在細胞膜上相關的核酸內切酶降解雙鏈中非轉化的一條DNA單鏈，同時，那條互補鏈進入細胞質[7]。單鏈DNA進入與降解的過程幾乎是同步進行的。

2.3 外源DNA進入細胞并進行同源重組 進入R菌細胞質的單鏈DNA片段被SsbB(單鏈DNA結合蛋白)包裹，以防其被核酸酶降解，并為重組做好準備[5]。因為R菌的基因組與轉化進來的S菌單鏈DNA有很多同源的區域，所以被轉化進來的單鏈DNA可以整合到R菌的染色體上，從而使R菌的基因組發生改變，由于重組的這段DNA片段攜帶莢膜基因，所以使R型菌恢復了產生莢膜的能力，這樣經過細胞分裂產生的子代細胞就會產生莢膜，成為S菌。

3 外源DNA進入受體細菌細胞的方式

細菌攝入外源DNA主要有三個方式：轉化、接合、轉導[8]。格里菲斯的實驗就是轉化實驗。在自然情況下，某些細菌溶解以后釋放的DNA不通過其他媒介被其他細菌吸收而發生轉化。現在我們說到的轉化，經常是指基因工程實驗過程中，從細菌里面純化的 DNA 分子直接導入遺傳性狀相異的細菌，如質粒轉化用的是純化的質粒 DNA 本身，沒有任何媒介幫助。從這個概念的內涵來說，只要 DNA 進入細菌，就完成了轉化過程，這里不涉及轉化的 DNA 是否復制，也不涉及是否改變細菌的遺傳性狀，以及外源基因是否表達等。進入受體細胞的外源DNA要通過復制、基因表達、或者整合進受體菌的染色體，才最終完成轉基因的過程。

接合是在細胞與細胞接觸時發生的，兩個細胞接觸處形成結合通道，單鏈DNA可以通過這個通道從一個細胞轉移到另一個細胞。最先被發現在細菌接合作用時被轉移的質粒是大腸桿菌Escherichiacoli的F因子，一種微小的質粒，不是每個細菌細胞中都含有這種游離的F因子，只有供體細胞才有F因子，這種菌株被稱為F+，受體細胞沒有F因子，這種菌株稱為F-。F+細胞利用性菌毛識別F-細胞并進行細胞膜的融合，形成細胞質橋。F因子是環狀雙鏈DNA，在轉入之前，其中的一條單鏈被切開，以切口為起點，將此單鏈傳到F-細胞，然后以單鏈為模板合成完整的F因子。通過接合作用受體細胞可以得到不同的抗性基因或新的代謝基因組，從而在不同的環境下生存。

轉導是指通過病毒將一個細菌的DNA轉移到另一個細菌的細胞中而引起的基因重組現象。轉導這個概念涉及三個關鍵點：病毒、宿主DNA、整合。轉導通常以噬菌體為媒介，用噬菌體的外殼將外源DNA包裹進去，成為有活力的噬菌體，然后以感染的方式將DNA轉移到另一個細菌，從而使目的基因在該菌中復制繁衍。噬菌體轉導技術提高了外源DNA轉入細菌的效率，經常被用于DNA文庫的建立。

4 總結

對于格里菲斯的肺炎雙球菌轉化實驗，實驗已經明確揭示進入到R型菌并與染色體發生重組的是S型菌的染色體DNA片段。S菌的DNA進入R型菌的前提是R型菌為感受態細胞，在此情況下，R菌可以攝取S菌的DNA片段，并通過各種調控機制使S菌的DNA以單鏈的形式進入，進入R菌細胞的DNA片段最終與R菌的染色體發生同源重組，轉變為具有產莢膜能力的S菌。

(*通信作者)