基因編輯神器
——CRISPR技術

黃俊駿 王華華 候俊杰 梁衛紅

(河南師范大學生命科學學院 新鄉 453007)

1 什么是CRISPR

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是指基因序列上成簇的規律間隔的短回文重復序列。CRISPR本身是大多數細菌及古細菌中的一種防御系統，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。在這些生物基因組中的CRISPR位點上能表達與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子RNA。當微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA就能通過互補序列結合病毒基因組，并表達CRISPR相關酶(核酸酶Cas)，它能靶向切割病毒DNA，進而阻止病毒完成其功能[1]。可以說，CRISPR就是一把“分子剪刀”，能夠剪斷DNA分子。

2 何謂CRISPR技術

此前多種基因編輯技術(例如，ZFN/TALEN技術[2]、RNAi技術)已經得到廣泛應用。而CRISPR技術因相對較為簡單、廉價和高效，而且可以多處打靶，逐漸處于基因編輯技術領域的統治地位。

目前，科學家使用的CRISPR技術是由最簡單的type II CRISPR改造而來，由有核酸內切酶活性的Cas9蛋白和單鏈的導向RNA組成[3]。通過核酸內切酶蛋白Cas9引起DNA雙鏈的斷裂，而細胞通過非同源末端連接(NHEJ)的修復會造成插入和缺失(INDEL)效應，進而造成基因的移碼突變而達到基因敲除的目的[2]。

3 如何使用CRISPR技術

將細菌的天然免疫防御系統CRISPR用于其他非細菌細胞時需要滿足兩個條件：①核酸酶Cas蛋白，用于切斷目的基因中的靶向DNA片段；②導向RNA的RNA分子，它既能通過互補靶向DNA結合目的基因，又能與核酸酶Cas蛋白形成復合物，進而指導核酸酶Cas蛋白到達正確的剪切位點[4]。因此，在整個基因編輯的過程中，只需要導入編碼向導RNA和Cas蛋白的質粒即可。一旦在細胞中表達了向導RNA和Cas9蛋白，那么這一復合物就能完成余下的工作，輕而易舉地切斷靶向DNA的兩條鏈。

目前，科研人員已經研發出各種各樣的載體來滿足不同的生物體系，可直接從Addgene公司網站上查詢和選擇合適的CRISPR/CAS系統[5]。同樣，在目的基因靶向DNA區域選擇合適的位點時，也可從相關的的網站上[6]進行查詢。然后研究人員可通過改變Cas活性，或結合其他元件，來達到調整這種工具在基因校正和基因調控方面作用的目的。

4 CRISPR技術有哪些應用

CRISPR技術已成功應用于動物、植物和微生物等諸多物種的基因組改造，例如，Zhang等人將編碼Cas9蛋白的mRNA和兩條向導RNA分子直接注入小鼠的受精卵細胞中，成功地敲除了兩個基因，成功率達到了80%，并且只需要數周的時間[7]；中國科學院北京遺傳及發育生物學研究所Gao的團隊利用CRISPR技術已經成功地使OsPDS等4種水稻基因失活，該研究首次證實CRISPR-Cas系統能夠用于植物的基因組編輯；隨后又利用該技術將小麥中的TaMLO基因敲除，得到耐白粉病的小麥新品種[8]。 Zhang等人最近又構建出一種新的小鼠模型，簡化了CRISPR-Cas9系統在體內基因組編輯實驗中的應用，并且構建出最致命的一種人類癌癥——肺腺癌的模型[9]。

5 CRISPR技術有何意義

CRISPR技術從2012年底出現至今，可謂是生物界的焦點。CRISPR技術相對于RNAi、ZFN/TALEN等基因打靶技術來說，具有更簡便、更經濟等優勢，應用越來越廣泛。一般的實驗室都可以自主構建平臺，為研究者解析生物基因功能提供了一種更加有效的辦法。2014年，《自然·方法》雜志在十周年之際推出紀念特刊，點評了在過去十年中對生物學研究影響最深的十大技術，CRISPR赫然上榜。CRISPR技術讓人們從全新的角度去認識微生物中內在和相互之間的調控網絡和調控機制，認識原核細胞和真核細胞之間的聯系和異同，甚至獲得協同進化的證據。隨著CRISPR技術在人類醫療和農業生產的潛在應用價值的提升，這個技術還由于可能被用來培育和設計嬰兒、治療遺傳病或解決人類進化過程中的缺陷而引發社會的廣泛關注。例如，早在20世紀70年代末，科研人員就已經能夠通過大腸桿菌進行胰島素的生產，這意味著基因編輯技術在生物醫學領域存在巨大的應用潛力；人類基因組測序早已于2005年完成，但關于人類絕大多數的基因的具體功能和作用的研究并沒有取得突破性的進展，瓶頸就在于當時的基因編輯技術操作過程太過復雜、耗費昂貴等，而這一切都將因為CRISPR技術的出現而發生巨大的改變。