離體培養基誘導型愈傷組織形成的分子機制

張 騰 張 偉 于振林

(華東師范大學生命科學學院 上海 200241)

1 愈傷組織概述

20世紀初，德國植物學家Haberlandt根據細胞學理論，提出高等植物細胞具有全能性的觀點，而后美國科學家White發明了離體培養愈傷組織技術，并在煙草組織培養過程中發現芽的形成，從而證實Haberlandt的論點，同時也完善了愈傷組織的定義：高度分化的細胞或組織經脫分化過程形成的無序薄壁細胞群[1]。

近年來，科學家根據是否存在明顯的器官從頭再生能力，將愈傷組織分為兩類：離體培養基誘導型(CIM-callus)和傷口誘導型(wound-callus)。離體培養基誘導型愈傷組織指的是植物離體的外植體材料在植物激素(生長素、細胞分裂素)的誘導下可以形成并完成繼代培養的一類愈傷組織，這類愈傷組織的形成過程與根的從頭再生過程十分相似，也會表達不定根形成過程中的標志基因，如SCR基因、WOX5基因等。對于傷口誘導型愈傷組織而言，可以形成這類愈傷組織的植物細胞種類較多(如髓細胞、維管柱細胞、皮層細胞等)，并常含有大量的植物抗菌素和病原菌相關蛋白，參與植物的防御與修復過程。這類愈傷組織也有可能發育成完整植株，但這主要歸結于植物細胞具有潛在的全能性，其在形成過程中并不會表達不定根形成過程中的相關基因[2]。兩類愈傷組織的形成及分化的分子信號通路是不一樣的，本文主要介紹近年來研究比較活躍的離體培養基誘導型愈傷組織形成的分子機制的研究進展。

2 WOX基因與根的從頭再生過程

與動物細胞不同的是，植物具有細胞、組織或器官再生，并再次形成一個完整植株的能力[3]。器官從頭再生主要指的是受傷或離體的植物器官重新再形成不定根或不定芽的過程[4]。在根從頭再生的過程中，植物細胞經歷了兩次命運的轉變：第一次是由原形成層細胞向根母細胞發生轉變；第二次則是由根母細胞向根原基細胞轉變，根原基細胞不斷分裂增殖最終形成不定根。

WOX(WUSCHEL-related homeobox)轉錄因子家族是植物特有的一類同源框轉錄因子, 一般在植物細胞增殖分化較為旺盛的區域發揮重要的調控作用。其中，WOX4基因主要在原形成層及形成層中表達，可以維持維管形成層形態以及促進形成層細胞的增殖，因而常作為原形成層細胞的標志基因。而WOX5則是根原基細胞的標志基因，一般位于根尖分生組織中，常與其他WOX家族基因協同維持著干細胞的穩定性[5，6]。WOX11主要分布在根尖分生組織、根部原生木質部細胞中，常用于根母細胞的標記。

研究發現，在擬南芥葉片外植體誘導形成不定根的過程中，起始階段，植物的離體葉片傷口附近的WOX4基因大量表達，該處原形成層細胞大量增殖；一段時間后，WOX11基因在之前的原形成層部位開始大量表達，原形成層細胞開始分化為根母細胞，發生第一次細胞命運轉變；同時WOX5開始大量表達，之前的根母細胞已經分化為根原基細胞，完成了第二次的細胞命運轉變[7]。

此外，在根的從頭再生過程中，WOX11是不定根生長發育的關鍵調節基因。在水稻中的研究表明，WOX11基因的低表達或缺失突變體都會使不定根的數目減少并且減緩其生長速率；相反，WOX11的過表達則會使不定根提早產生，并且相應的生物量也顯著增加[8]。

3 WOX基因與離體培養基誘導型愈傷組織的形成過程

3.1 與根的從頭再生過程十分相似 愈傷組織一直被認為是植物器官外植體脫分化后形成的具有分化潛能的無序細胞團。然而，對于離體培養基誘導型愈傷組織而言，其結構并非以往研究認為的無序雜亂狀態。例如，在對擬南芥芽或根的外植體愈傷組織進行離體培養基誘導過程中，這些愈傷組織來源于木質部附近的中柱鞘細胞，與不定根的結構十分相似。相關研究進一步在轉錄水平上證明：這種類型的愈傷組織在形成過程中，會有與不定根形成過程中相同的標志基因表達[9]。

徐麟等利用擬南芥葉外植體，證實在離體培養基誘導型愈傷組織形成過程中，WOX4、WOX11、WOX5發生了時空特異性表達，而這一過程與根的從頭再生過程十分相似[7]。這一結果也證明愈傷組織是通過根原基細胞不斷分裂增殖、規則排列形成的。由此可見，WOX家族基因在離體培養基誘導型愈傷組織形成過程中起到類似開關一樣的調控作用。

3.2 轉分化的作用 由上可知：離體培養基誘導型愈傷組織的形成過程可能與根的從頭再生分享著相似的分子信號通路，而并非一概而論的脫分化過程。所謂脫分化，即細胞重新進入細胞周期，由已經高度分化的狀態退回到干細胞或者干細胞樣細胞狀態(可以長期自我更新并且可以繼續分化成一種或多種細胞類型)[10]。離體培養基誘導型愈傷組織經實驗證明其細胞狀態屬于根原基細胞，而非干細胞，即原本高度分化的成熟細胞，轉變其正常的細胞命運，向其他分化或未分化方向的細胞轉化，而非由成熟細胞直接脫分化成為干細胞或者干細胞樣的細胞狀態。因此，用“轉分化”可以更貼切地體現離體培養基誘導型愈傷組織的形成過程。

3.3 復雜的分子網絡 無論是根從頭再生過程，還是愈傷組織形成過程，傷口信號都是整個過程的起點[11]。傷口信號可以通過一系列分子通路招募大量的生長素和細胞分裂素(具體的分子信號通路未知)[12]。在這個過程中，生長素發揮了重要作用。在植物體內，生長素受AUX/IAA和ARF蛋白家族調控，促進AUX/IAA蛋白降解，進而激活生長素響應因子ARF7/19，啟動下游的WOX11—LBD16/17/18/29—WOX5信號通路，最終形成愈傷組織或根原基[1]。除了植物激素誘導的上述信號通路外，細胞周期調控的相關基因(CDK、CYC等)、愈傷組織形成的負調控基因(例如，細胞壁形成調控基因等)都會參與其中，共同構成復雜的愈傷組織形成的分子網絡。

4 展望

離體培養基誘導型愈傷組織研究的結果，一方面有助于新的基因標記的開發，可以通過檢測WOX11的表達情況來確定愈傷組織形成情況；另一方面有利于植物遺傳體系的建立，對植物誘導過程進行監控，從而幫助確定愈傷組織的最佳活力，為瀕危植物的研究與保護提供幫助。植物愈傷組織與根原基細胞的關系的揭示，也為愈傷組織形成的分子機制提供一個新的研究思路。