長鏈非編碼RNA在哺乳動物精子發生中的功能研究進展

伍仕鑫， 徐傳飛， 孫磊， 趙旺生， 蔡欣

(西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010)

伍仕鑫， 徐傳飛， 孫磊， 趙旺生， 蔡欣*

(西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621010)

長鏈非編碼RNA(lncRNA)一般是指大于200 nt的RNA，位于細胞核內或胞漿中，不參與蛋白質編碼，以RNA形式在表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等多個層面上調控基因的表達水平。哺乳動物精子發生是一個精細調控的過程，通過雄性生殖細胞分裂和分化形成成熟精子，且精子發生受到不同階段特異性基因表達的嚴格調控，而特異性基因表達又受到大量lncRNAs的調控。雖然lncRNA作為一類重要的基因表達調控因子廣泛參與各類生物個體發育進程和疾病的發生，但是精子發生相關lncRNAs的報道并不多，且其生物學功能的研究有待進一步深入。因此，本文對lncRNA的起源、作用機制和在精子發生過程中調控作用的研究進展進行了總結分析。

lncRNA；起源；作用模式；哺乳動物；精子發生

長鏈非編碼RNA(lncRNA)占非編碼RNA(ncRNA)的80%，多由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成(Gong & Maqual，2011)，其堿基組成從200 nt到100 000 nt 不等(Brosnan & Voinnet，2009)。LncRNA位于細胞核內或胞漿中，轉錄水平低于蛋白質編碼基因，不參與蛋白質編碼。其以RNA形式在多個層面(表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等)上調控基因的表達水平(Merceretal.，2009)。然而，越來越多的證據表明，lncRNAs不是基因組的“暗物質”，它們在各種生物過程中發揮重要的監管作用，包括X染色體失活、基因組印記、細胞分化、細胞凋亡、干細胞多能性、大腦發育、視網膜發育、核運輸、熱休克反應以及基因組重排(Mattick，2011a，2011b)。在對若干來源于多個小鼠組織的全長cDNA文庫進行分析后發現，大量的lncRNA基因呈現出組織特異性的表達(Ravasietal.，2006)，隨后有研究者利用原位雜交技術在小鼠腦組織中鑒定出了大量表達水平與特定細胞類型相關的lncRNAs(Merceretal.，2008)。很多lncRNAs在染色體上具有特異的基因座位，表明它們的轉錄受到動態調控，這種調控具有明顯的細胞特異性(Guttmanetal.，2009)。

目前對雄性生殖細胞發育中lncRNA的研究日漸增加，但是在精子發生中只有少數lncRNAs，如Tsx、HongrES2、Mrhl和Spga-lncRNA被報道(Ganesan & Rao，2008)。LncRNAs的表達譜具有組織或細胞特異性(Rasmussenetal.，2000；Parketal.，2002；Prasanthetal.，2005；Pandeyetal.，2008)，而這在2005年于模式動物中才有以組織和細胞特異性方式表達的大量lncRNAs被報道(Inagakietal.，2005)，因此在雄性生殖細胞發育中只鑒定出少量的lncRNAs(Ganesan & Rao，2008)。

1 LncRNA來源及其作用機制

1.1 LncRNA的起源

大多數ncRNA受到低程度的進化限制，只有小部分在不同物種之間表現出序列保守性(Kutteretal.，2012)。與蛋白質編碼基因不同，ncRNA基因不形成大的同源家族。除轉位因子外，ncRNA的序列都不具有相似性。LncRNA有以下幾種產生方式：(1)一個蛋白質編碼基因發生一次框插入，轉變為一個與先前編碼序列合并的有功能的lncRNA。參與細胞發育過程中X染色體失活的X染色體特異性失活轉錄物(X inactivation-specific transcript，Xist)是這種生成方式的有力佐證(柏慶然，宋旭，2010)；(2)在染色質重排之后，導致2個原本距離較遠的非轉錄片段串聯到一起，產生一個含多個外顯子的ncRNA。犬科Canidae動物睪丸中有一種跨越2個區域并被數十兆核苷酸分開的ncRNA，而在其他真獸類哺乳動物中仍保留有祖先染色體的結構，這也是對染色體重排后產生ncRNA這一推測的有力佐證；(3)非編碼基因通過反轉錄轉座作用復制，產生一個有功能的非編碼反義基因，或者產生一個沒有功能的非編碼反轉錄假基因；(4)ncRNA內部某段序列的重復復制，產生了具有相鄰重復序列的lncRNA。如在Kcnq1ot1和Xist轉錄本的5’端發現了重復序列；(5)轉座元件插入基因組中產生一個有功能的lncRNA。如RNABC1(brain cytoplasmic RNA 1)和BC200(brain cytoplasmic RNA 200-nucleotide)這2類ncRNA就源于不同的轉座元件(Pontingetal.，2009)。

1.2 LncRNA的基本功能

LncRNA可在多個層面調控基因的表達水平，主要在表觀遺傳調控、轉錄調控及轉錄后調控3個層面上調控基因的表達。隨著對lncRNA研究的深入，許多新的與基因調控相關的lncRNA被發現，而多年的研究也已經證實lncRNA與表觀遺傳調控的關系十分密切(Probstetal.，2009)。在表觀遺傳水平，lncRNA可通過DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質重構等機制影響基因的表達(Shietal.，2013)。分別與基因組印記和X染色體失活相關的H19和Xist則是參與表觀遺傳調控中最先被研究的lncRNAs(Yang & Kuroda，2007)。轉錄自同源異型框基因C(homeobox C，HOXC)位點的同源異型框基因反義基因間RNA(HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR)能夠通過反式調節作用募集多梳抑制復合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)并將其定位到HOXD位點，進而誘導HOXD基因座上長達40 kb的轉錄本發生表觀遺傳沉默(Jonkersetal.，2008)。在轉錄水平，lncRNA可以通過干擾鄰近基因的表達、與DNA堿基互補形成復合物、與轉錄因子或RNA聚合酶Ⅱ相互作用以及作為內源性競爭性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調控靶基因的轉錄(Bonasio & Shiekhattar，2014；Maetal.，2014)。如DNA損傷信號誘導人類的細胞周期蛋白D1(cyclin D1，Ccnd1)啟動子上游一段lncRNA的表達，進而調節RNA結合蛋白TLS的活性，隨后TLS抑制環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP responsive element-binding protein，CREB)的表達，使Ccnd1基因的表達沉默(Wangetal.，2008)。在轉錄后水平，lncRNA可與microRNA(miRNA)結合抑制miRNA的功能，或者調控mRNA的可變剪接，也可與mRNA互補配對形成雙鏈RNA，改變其穩定性(Yoonetal.，2013)。如具有MRE轉錄本的lncRNA在人和鼠的骨骼肌分化過程中可以競爭結合miRNA并調控miRNA及靶基因的表達(Cesanaetal.，2011)。

2 LncRNA在精子發生中的調控功能

精子發生是一個復雜而精巧的過程，精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)在曲細精管基底膜增殖并連續分化成各種生精細胞，包括精原細胞、精母細胞、精子細胞和釋放到曲細精管管腔的成熟精子。成熟精子的形成依賴于精確的轉錄程序，并涉及復雜的基因表達調控過程，包括表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等，其中任何一個環節出錯都可能導致生精障礙。生精障礙是雄性不育的主要原因，目前雄性不育占全世界診斷不孕病例的一半以上，所以哺乳動物成功的精子發生在生殖發育以及物種延續中具有重要作用。最近發現的lncRNAs作為正常機體和疾病發生的關鍵調節因子，可為解析雄性生殖細胞發育的分子調控機制提供新的線索。

LncRNA作為新一類重要調控因子，在精子發生過程中的相關研究較少，目前只有少數被功能注釋和深入研究，在雄性生殖細胞發育中仍有許多潛在的lncRNAs有待鑒定。一些lncRNAs由高通量的方法鑒定，其他的由從頭測序(denovosequencing)及其功能注釋鑒定。在精子發生中這些已被鑒定的lncRNA表達模式在圖2中予以闡明(Luketal.，2014)。對這些lncRNA調控作用的解析將為精子發生相關的新lncRNA的發現和鑒定提供參考。

圖2 在精子發生中的功能特性lncRNAs，其表達模式與特定的雄性生殖細胞一同標示(Luk et al.，2014)

2.1 LncRNA對精原干細胞多能性和分化的影響

原始生殖細胞隨著雄性動物的出生轉化為生殖母細胞，在遷移到生精小管基膜部后分化為SSCs。SSCs位于睪丸曲細精管靠近基底膜處，是雄性生殖腺內的一類原始精原細胞，其既能自我更新、維持自身群體恒定，又能定向分化產生精母細胞，SSCs代表了雄性生殖干細胞(male germline stem cells，mGSCs)有分化為各種雄性生殖細胞的能力。精子發生的整體過程非常復雜，涉及很多基因的時序性表達調控，而lncRNAs能夠調控基因的表達，具有非常廣泛的生物學功能。目前國內外研究主要集中在SSCs的分子標記、體外培養、增殖分化信號通路、移植和多能性等方面；到目前為止，關于lncRNA對精原干細胞增殖和分化的研究還較少。近幾年，lncRNA高通量測序及其數據庫的建立為研究lncRNA的功能提供了很好的平臺，其中lncRNA數據庫提供了目前已研究的、在真核動物體內發揮功能的lncRNAs的綜合信息。

自我更新和分化是干細胞的2個關鍵特性，而這些特性是通過轉錄因子Oct4、Sox2和Nanog等的精確轉錄調節機制維持。最近發現通過調節這些干性維持基因的表達可以闡明幾個lncRNAs在維持干細胞干性中的作用。通過全基因組篩選結合小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)全轉錄組數據分析以及mESCs轉錄因子Oct4和Nanog基因組位點的染色質免疫共沉淀定位，在Oct4和Nanog活躍的結合位點附近鑒定出4種高保守的lncRNA編碼基因，即AK005651、AK028326、AK043754和AK141205，其中AK028326和AK141205直接與Oct4和Nanog的調控相關。這些lncRNA轉錄本被敲除或過表達會導致Oct4、Nanog和其他細胞譜系特定基因的表達水平以及mESCs多向分化潛能的改變(Sheiketal.，2010)。考慮到lncRNAs在ESCs自我更新、多向分化潛能和分化過程中普遍發揮作用，而且ESCs和GSCs中lncRNAs分子水平的作用非常相似，可以預測在GSCs發生分化并獲得ESC樣干性特征的過程中可能也受到lncRNAs的調控。

AK011429是一個被確認為細胞周期蛋白D2(cyclin D2，Ccnd2)的外顯子正義轉錄本。AK011429與Ccnd2的表達譜呈正相關。而Ccnd2在精原細胞中高度表達，并在SSCs自我更新中扮演著一個重要的角色(Leeetal.，2009)。AK080917是一個在成年睪丸中下調的lncRNA，被認定為鋅指蛋白的內含子4和5與Zbtb16基因之間序列的正義轉錄本。Zbtb16在精原干細胞中高水平表達，是SSCs干性維持所需的關鍵基因(Costoyaetal.，2004)。AK080917和Zbtb16之間表達的正相關性表明兩者的功能或調控可能具有相關性。AK052984是在成年鼠睪丸中高度表達的lncRNA，來源于Hoxc4和Smug1基因間的序列。Hoxc4對于精原干細胞自我更新是必需的，且在新生兒睪丸中高度表達(Schmidtetal.，2009)。AK052984的表達與Hoxc4的表達呈負相關，因此，可以推測AK052984可能會影響Hoxc4的表達。

2.2 LncRNA對精原細胞分化的影響

有研究者通過整合SAGE數據(Leeetal.，2006，2009)和全基因組嵌合微陣列數據(Leeetal.，2012a)來鑒定lncRNA，此種方法已經用于研究3種關鍵生精細胞(A型精原細胞、粗線期精母細胞、圓形精子細胞)轉錄組差異表達的編碼基因。Lee等(2012b)利用上述方法分別在A型精原細胞、粗線期精母細胞、圓形精子細胞中鑒定出特異性表達的50個、35個和24個單外顯子lncRNAs，通過qPCR、northern blot和RACEs進一步驗證了精原細胞中2個名為Spga-lncRNA1和Spga-lncRNA2的特異性lncRNA在體外細胞模型中表現出的明顯分化抑制作用，表明它們可能對于精原細胞干性的維持具有重要的作用。

與Dsx- and Mab3-related transcription factor-1(Dmrt1)有關的基因Dmr(Dmrt1-related)是睪丸特異功能lncRNA中一個有代表性的lncRNA。它在無意中被發現，研究者試圖克隆Dmrt1基因，卻在其3’鏈中間區段發現了一個意想不到的具有特定序列的新型RNA異構體(Zhangetal.，2010)。通過基因定位表明此神秘的異構體實際是由5號染色體上一個基因編碼的，因此命名為Dmr，而Dmrt1是在19號染色體上的基因。換句話說，Dmr能夠形成一個反式剪接RNA異構體Dmrt1。這種嵌合mRNA的形成干擾Dmrt1的編碼區和取代Dmrt1的3’-UTR，均導致正常Dmrt1蛋白質的下調。由于Dmrt1蛋白質是一個重要的轉錄因子，可以通過上調轉錄因子spermatogenesis- and oogenesis-specific basic helix-loop-helix 1(Sohlh1)以維持支持因子的周期性表達來促進精原細胞發育，也可以通過抑制維甲酸(retinoic acid，RA)依賴性的stimulated by retinoic acid gene 8(Stra8)因子的表達，從而間接抑制RA的轉錄以阻止精原細胞過早減數分裂(Ottolenghietal.，2000，Agboretal.，2013)，此外，通過特異性敲除支持細胞中的Dmrt1基因，發現Dmrt1基因能夠通過影響支持細胞的成熟而影響精子發生(Agboretal.，2013)。所以Drm對Dmrt1基因的抑制也可能參與到生殖細胞發育的有絲分裂和減數分裂之間的轉換中。

當Nishant等(2004)在研究小鼠8號染色體新型減數分裂重組熱點區域內一個17.2 kb的片段時，鑒定出減數分裂重組熱點基因座(meiotic recombination hot spot locus，Mrhl)RNA。Mrhl是一個位于細胞核的2.4 kb單外顯子lncRNA，由小鼠基因組編碼，并在睪丸、肝、脾、腎臟中表達(Nishantetal.，2004)。隨后的研究表明Mrhl RNA可能通過2種分子機制調控精子發生。一是通過Drosha分裂Mrhl形成一個80 nt的RNA中間體。證據表明這些RNAs都位于GC1精原細胞系的細胞核內，暗示其與染色質可能存在互作的關系(Ganesan & Rao，2008)。除此之外，Mrhl RNA是第一個顯示調節Wnt信號的lncRNA，而Wnt信號在調節哺乳動物精子發生過程中起著非常重要的作用(Kerretal.，2014)。Mrhl可以通過與p68互作在小鼠精原細胞的Wnt信號中發揮負調控作用。在GC-1 Spg細胞系中降低Mrhl RNA的表達，能導致一些與細胞黏附、細胞信號轉導和細胞發育及分化相關基因表達的紊亂，這其中大多是Wnt信號通路中的基因(Arunetal.，2012)。然而，這個lncRNA對精子發生的調控作用仍需要通過基因敲除動物模型來進一步研究。

2.3 LncRNA對精母細胞減數分裂的影響

減數分裂作為雄性生殖細胞增殖過程中的一種特殊分裂方式，在精子發生中受到調節因子的嚴格調控。在減數分裂期間，染色體會經歷包裝、配對和重組等一系列的結構變化，而染色體域經由甲基化的異染色質化是這些過程的必要條件。G9A是一個在體細胞常染色質區域參與賴氨酸殘基9單一二甲基化作用的組蛋白甲基轉移酶，已被證明與雄性減數分裂有關。敲除G9a基因后會導致胚胎在妊娠中期死亡，而且G9a基因敲除小鼠的雄性不育可歸因于初級精母細胞在減數分裂粗線期發生的阻滯(Tachibanaetal.，2007)。如Kcnq1ot1和Air等lncRNAs被發現與G9a存在交互作用，通過染色質修飾機制來調節多個基因的轉錄沉默。Kcnq1ot1是小鼠胎盤中一個源于父本等位基因表達的90 kb lncRNA，與G9a和PRC2互作，通過招募多聚復合物有效地在其轉錄位點形成順式抑制結構域(Pandeyetal.，2008)。Air轉錄單位在小鼠Igf2r(insulin-like growth factor 2 receptor)基因第二內含子啟動，并招募G9a到其目標啟動子使基因沉默(Naganoetal.，2008)。LncRNA和G9a在小鼠生精細胞減數分裂過程中的互作機制是基于染色質重塑器(chromatin remodelling machinery)的募集與轉錄抑制。一些已知單倍體雄性生殖細胞的lncRNAs在成年睪丸組織中上調表達，例如Aldoart2、Speer9-ps1；而一些印記lncRNAs下調表達，如H19、Meg3和Airn等。早期的研究發現著名的父本印記基因H19的甲基化在精子發生過程中呈連續性，小鼠H19的甲基化始于胚胎發育的E15.5期到E18.5期，在出生后的粗線期精母細胞中則被完全甲基化(Davisetal.，1999)。

Testis-specific x-linked(Tsx)以前被認為是一個位于染色體失活中心的蛋白質編碼基因，但隨后被證明是一個lncRNA。人和小鼠的Tsx基因在外顯子1、3、4、5和6區域具有非常明顯的高度同源性(Sado & Brockdorff，2013)。Tsx突變雄性小鼠由于粗線期精母細胞的特異性凋亡導致其睪丸體積明顯比野生型小，表明Tsx參與了雄性生殖細胞的發育，與此同時，Tsx在粗線期精母細胞中特異性表達，而不是在精原細胞或圓精細胞期間，暗示其在生殖細胞減數分裂中具有一定的調控作用(Angueraetal.，2011)。TUNEL分析顯示，小鼠Tsx基因敲除后，粗線期精母細胞凋亡的比例異常高，表明這些lncRNAs在減數分裂進程中至關重要，但其具體作用機制還有待進一步研究。

AK077193是聯會復合體蛋白2(synaptonemal complex protein 2，Sycp2)的外顯子反義轉錄本，而Sycp2對于精母細胞特異性基因在雄性減數分裂期間的聯會復合體裝配和染色體聯會是必需的(Yangetal.，2006)。數據顯示AK077193在成年睪丸中上調表達，且AK077193和Sycp2之間的表達呈正相關(Sunetal.，2013)。因此，可以推測AK077193有可能調節Sycp2的表達。

2.4 LncRNA對精子成熟的影響

HongrES2是一個1 588 bp的lncRNA，在附睪尾區特異性表達(Nietal.，2011)。HongrES2作為一個1.6 kb mRNA-like的前體，可在大鼠附睪中產生一個新的類似microRNA的小RNA(mil-HongrES2)。附睪特異性羧酸酯酶7(carboxylesterase 7)在HongrES2的3’末端有100%同源的cDNA序列，其蛋白產物可以通過mil-HongrES2由HongrES2引起下調，進而影響膽固醇酯酶的活性，膜的流動性隨精子膜中膽固醇/磷脂類的比例降低而增強，有利于精子的獲能(Zhangetal.，2009)，由此mil-HongrES2能夠參與精子在附睪中的成熟過程。此外，通過整體酪氨酸磷酸化水平分析表明，mil-HongrES2的過度表達會導致精子獲能的弱化(Nietal.，2011)，這表明在附睪中正常的精子成熟過程中，內源性低水平表達的HongrES2具有關鍵的調控作用。

Narcolepsy candidate-region 1 genes(NLC1-C)是一種僅在精原細胞和早期精母細胞表達的基因間lncRNA，主要表達于細胞質，其在精子的成熟阻滯(maturation arrest，MA)患者中的表達量降低，但在細胞核中的表達上調。微陣列分析技術可見健康對照者與MA患者的睪丸lncRNA表達譜之間存在明顯差異(Lüetal.，2015)。NLC1-C在細胞質的過表達能夠促進細胞增殖，若被敲除，則細胞增殖受到抑制并加速凋亡。此外，NLC1-C能夠與位于核仁素的RBD結構域結合共同抑制miR-320a和miR-383的轉錄，而miR-320a和miR-383在加工成熟后則能直接抑制NLC1-C的作用以此調節細胞的存活。由此細胞核內NLC1-C的高表達可以加強對miR-320a和miR-383的轉錄抑制，進而導致精原細胞和初級精母細胞的過度增殖和成熟阻滯(Lüetal.，2015)。

2.5 LncRNA與細胞凋亡

AK005744是一個源于spermatogenesis associated 17(Spata17)的內含子6和7區域之間的內含子反義轉錄本，在睪丸中特異表達和在成年睪丸中上調；而Spata17是參與雄性生殖細胞凋亡的睪丸特異性基因，并在成年睪丸中高表達(Dengetal.，2005；Nieetal.，2013)。AK005744和Spata17表達譜的正相關性表明它們之間可能有一定的調控關系。LncRNA033862是一個位于Gfra1內的GDNF調控反義lncRNA轉錄本，主要在小鼠睪丸的精原細胞中表達。LncRNA033862通過RNA-DNA相互作用和介導GDNF受體基因Gfra1的轉錄激活來調節SSCs的存活及增殖(Lietal.，2016)。

3 總結與展望

近年來，大量研究表明lncRNAs在哺乳動物精子發生過程中具有重要的調控作用，包括精原細胞增殖、精母細胞減數分裂和圓形精子的形態變化等一系列過程。雖然在精子發生的特定階段有少數lncRNAs的調控功能已得到確定，但還有很大一部分與精子發生相關的lncRNAs及其具體的調控功能有待研究。鑒于lncRNAs的重要調節作用，基于生物信息學方法對lncRNAs的功能注釋和預測將是研究lncRNAs功能的主要手段之一。目前關于lncRNAs的功能注釋方法主要包括基于共表達、miRNA調節、蛋白質結合、表觀遺傳修飾和基于ceRNA調節的方法。這些方法在一定程度上對lncRNAs的功能研究起到推動作用。LncRNAs在雄性生殖細胞研究中作為一個有吸引力的研究方向，隨著高通量測序、強大的生物信息學分析、ontology數據庫和蛋白質RNA結合模型的應用，更多的功能性lncRNAs可以被鑒定。因此，未來的研究鑒定基因組中以前的“暗物質”lncRNAs，必定會在精子發生過程中獲取更多與lncRNAs相關的研究成果。與此同時，在生精障礙的情況下盡快鑒定出更多與此相關的lncRNAs，將有助于男性不育診斷技術和相關治療藥物的研發。

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Progresses of Research on the Function of LncRNA Involved in Mammalian Spermatogenesis

WU Shixin， XU Chuanfei， SUN Lei， ZHAO Wangsheng， CAI Xin*

(College of Life Science and Engineering， Southwest University of Science and Technology， Mianyang， Sichuan Province 621010， China)

Long non-coding RNA (lncRNA) is the functional RNA segment longer than 200 nucleotides， locating in the nucleus or the cytoplasm， with little or no protein-coding capacity. LncRNAs can regulate gene expression at epigenetic， transcription and post-transcription level. Spermatogenesis is a well-orchestrated biological process， which is composed of meiotic division of spermatocytes and post-meiotic differentiation of haploid spermatids into mature spermatozoa. This process is strictly modulated by phase-specific gene expression under the regulation of plenty of lncRNAs. Although lncRNAs widely participate in various physiological and pathological processes as a new class of important regulatory factors， yet little information is available in the process of spermatogenesis. The identification of spermatogenesis-related lncRNAs and their biological function research are still remaining unknown. Therefore， this article summarized the recent research progresses on the origin and function mechanism of lncRNAs as well as their regulatory roles in spermatogenesis.

lncRNA； origin； mechanism； mammal； spermatogenesis

2016-06-22 接受日期：2016-10-19

國家自然科學基金項目(31572396)

伍仕鑫(1994—), 男, 碩士研究生, 主要從事動物分子遺傳學研究, E-mail：2670809401@qq.com

*通信作者Corresponding author, E-mail：caixin2323@126.com

10.11984/j.issn.1000-7083.201600171

Q752

A

1000-7083(2017)01-0114-07