何首烏苷對亞急性衰老模型小鼠學習記憶能力及海馬內ChAT和AChE表達的影響

俞云， 汪佰莉， 張雨， 趙宇， 覃筱燕

(1.中央民族大學生命與環境科學學院，北京100081； 2. 中央民族大學北京市食品環境與健康工程技術研究中心，北京100081； 3. 中央民族大學醫院檢驗科，北京100081)

何首烏苷對亞急性衰老模型小鼠學習記憶能力及海馬內ChAT和AChE表達的影響

俞云1， 2#， 汪佰莉1， 3#， 張雨1， 2#， 趙宇1， 2*， 覃筱燕1， 2*

(1.中央民族大學生命與環境科學學院，北京100081； 2. 中央民族大學北京市食品環境與健康工程技術研究中心，北京100081； 3. 中央民族大學醫院檢驗科，北京100081)

目的 研究何首烏苷(PolygonummultiflorumThunb. glycoside)對亞急性衰老模型小鼠學習記憶能力及海馬組織內膽堿乙酰轉移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AChE)表達的影響。方法 采用AlCl3(10 mg·kg-1)灌胃及D-半乳糖(120 mg·kg-1)頸部皮下注射，持續處理60 d并通過跳臺逃避行為學實驗法篩選出亞急性衰老KM小鼠模型；將成功構建的衰老模型小鼠，雌雄各半，隨機分為5組，包括：衰老模型組、雌二醇陽性對照組(10 mg·kg-1)和何首烏苷高、中、低劑量組(劑量分別為：80 mg·kg-1、40 mg·kg-1、20 mg·kg-1)；并選擇健康小鼠作為正常對照組。治療組小鼠在造模后15 d起分別頸部皮下注射高、中、低劑量的何首烏苷和雌二醇，持續給藥15 d；衰老模型組和正常對照組小鼠分別給予等體積生理鹽水。利用跳臺逃避行為學實驗法判斷各組小鼠的學習記憶能力的變化和差異；利用Western Blot法檢測小鼠海馬體組織細胞內膽堿酯酶系統ChAT和AChE蛋白表達情況。結果 與正常對照組比較，各實驗組小鼠學習記憶能力顯著下降，小鼠跳臺回避錯誤次數顯著增加(P<0.05)；與衰老模型組比較，不同劑量何首烏苷組與雌二醇陽性對照組小鼠學習記憶能力明顯改善，小鼠跳臺回避錯誤次數明顯減少(P<0.05或P<0.001)，而不同劑量何首烏苷組與雌二醇陽性對照組小鼠跳臺回避錯誤次數相近(P>0.05)；與衰老模型組比較，不同劑量何首烏苷組與雌二醇陽性對照組小鼠海馬體組織細胞內的ChAT表達量升高而AChE表達量下降，差異有統計學意義或高度統計學意義(P<0.05或P<0.001)。結論 何首烏苷能有效改善亞急性衰老模型小鼠的學習記憶能力障礙，其機制與其使海馬內組織細胞的ChAT表達升高和AChE表達降低，從而增加乙酰膽堿的含量以改善膽堿能系統損害有關。

何首烏苷；亞急性衰老模型小鼠；學習記憶；ChAT；AChE

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)導致患者進行性的學習記憶能力下降與腦內膽堿能遞質系統功能的減弱有關(Ballardetal.，1995；Karranetal.，2011)。動物長期小劑量注射D-半乳糖(D-galactose，D-Gal)聯合AlCl3灌胃的方法近年來常被應用于建立衰老和腦老化的動物模型(Xiaoetal.，2011；Yangetal.，2013)。采用該方法建立的模型小鼠出現了膽堿能神經元及其他神經元不同程度的丟失，學習記憶能力減退，腦組織出現β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積并有老年斑(senile plaques，Sp)和神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)形成，能較成功地模擬AD發病及其病理特征(Xiaoetal.，2011；Yangetal.，2013)。

隨著全球人口老齡化，AD引起的老年癡呆癥患者發病率逐年升高，成為影響老年人生活質量的主要疾病之一。研究證實，AD患者伴有腦中多種神經遞質的紊亂，包括乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)系統、單胺系統和氨基酸類神經遞質，其中以ACh的減少最為突出，AD患者的癡呆程度與新皮質和海馬中ACh缺失程度密切相關(Auldetal.，2002；Orgogozoetal.，2002)。在AD患者腦內，膽堿能神經元明顯喪失，膽堿能神經纖維發生退行性改變，膽堿乙酰轉移酶(choline acetyl transferase，ChAT)和乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase，AChE)異常表達。同時，AD患者腦內ACh的作用位點，煙堿型乙酰膽堿受體和毒蕈堿型乙酰膽堿受體在與學習和記憶密切相關的大腦皮層和海馬明顯減少(Auldetal.，2002；Orgogozoetal.，2002；Lietal.，2012)。目前，膽堿能假說已成為AD發病機制中最重要的假說之一，對AD的治療有一定指導意義。

何首烏PolygonummultiflorumThunb.是蓼科Polygonaceae何首烏屬Polygonum多年生纏繞藤本植物，有補肝益腎功效，可通過“補腎”而“生髓”“健腦”，用于增加老年性癡呆患者的記憶功能。研究報道以何首烏為主藥的復方口服液對老年癡呆小鼠模型有明顯的治療效果，能夠降低AChE活性(馬允等，2005)。何首烏的主要有效活性成分為2，3，5，4-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(THSG)，也叫何首烏苷(PolygonummultiflorumThunb. glycoside，PM)，其含量高且藥理活性明確(梅雪等，2016)。THSG對多種腦損傷動物模型的學習記憶障礙有一定的改善作用，同時具有抗氧化、清除自由基的功能(張蘭等，2004)，并能促進Aβ25-31誘導神經干細胞向神經元定向分化(張玉蓮等，2014)。前期在細胞水平的研究工作也揭示了THSG通過凋亡相關信號通路的蛋白分子來拮抗星形孢菌素所致的神經元毒性損傷(Yangetal.，2014)。本實驗采用AlCl3灌胃和D-Gal皮下注射建立亞急性衰老小鼠模型，進一步探討了PM對亞急性衰老模型小鼠學習記憶能力和膽堿酯酶系統的影響，為PM的開發利用提供理論基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

3月齡健康KM小鼠72只，雌雄各半，體質量34.06 g±5.15 g，購自北京市海淀區溫泉幸運飼養場，生產許可證號：SCXK-(軍)-2012-0004，使用許可證號：SCXK-(軍)-2012-0047。所有小鼠于清潔級動物室飼養，自由飲食，室內溫度20～25 ℃，相對濕度60%～80%，保持通風，定時換氣，每日光照/黑暗更替周期為12 h。

1.2 實驗藥物

PM購自北京欣科中晶生物科技有限公司，貨號：C20H2209，純度>98%。

1.3 實驗試劑

AlCl3、NaCl、D-Gal、雌二醇(estradiol，ED)均購自北京博揚宏達科技有限公司產品，貨號分別為：20140528、1104253、C2312-1、C2312-2；兔抗人ChAT抗體(rabbit，產品編號：TDY042F)、兔抗人AChE抗體(rabbit，產品編號：TDY048E)，均為Santa Cruz Biotechnology產品；鼠抗人Actin抗體(mouse，貨號：A5316)，為Sigma產品；山羊抗小鼠IgG(產品編號：MD161)、山羊抗兔IgG(產品編號：MD162)，為Cell Signaling產品；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(產品編號：H1211)，為Santa Cruz Biotechnology產品；組織裂解液、Tween-20為上海碧云天生物技術有限公司產品，貨號：T8200、922C042。

1.4 實驗儀器

YLS-3TB型跳臺記錄儀(北京微信斯達科技發展有限責任公司)；化學發光成像儀Tanon 4200(上海天能公司)；DYY-TC型電泳儀(北京六一廠)；恒溫水浴鍋(北京長風儀器儀表廠)；高速冷凍離心機5417R(德國Eppendodf公司)；低速常溫離心機TDL-40B(上海安亭公司)；TI-21半干法轉膜儀(美國Hoefer公司)等。

2 實驗方法

2.1 亞急性衰老模型的建立

參考相關文獻(Xiaoetal.，2011；王昱等，2015)構建亞急性衰老小鼠模型。篩選60只KM小鼠并隨機分為正常對照組、衰老模型組、ED陽性對照組(ED劑量為10 mg·kg-1)、何首烏苷高、中、低劑量組(H-PM、M-PM、L-PM組劑量分別為：80 mg·kg-1、40 mg·kg-1、20 mg·kg-1)，雌雄各半。除正常對照組外，各實驗組每天接受AlCl3(10 mg·kg-1)灌胃及D-Gal(120 mg·kg-1)頸部皮下注射，持續處理60 d；正常對照組每天接受等量蒸餾水灌胃及生理鹽水頸部皮下注射，持續處理60 d。通過跳臺行為學實驗篩選造模結果為陽性的小鼠：以正常對照組小鼠跳臺回避錯誤次數的均值為參考值，用衰老模型組的跳臺回避錯誤次數判斷小鼠造模結果，跳臺回避錯誤次數>正常對照組小鼠跳臺回避錯誤次數均值的20%即造模成功。

2.2 學習和記憶能力測試

采用跳臺行為學實驗(王昱等，2015)對衰老模型組和正常對照組小鼠進行訓練，根據跳臺回避錯誤次數的實驗數據判斷各組小鼠學習記憶能力的變化和差異。將小鼠放入反應箱內適應3 min，然后通以0.6 mA，30 V交流電流，小鼠受到電擊后將尋找跳臺以躲避電擊。記錄各組小鼠5 min內從跳臺跳下的錯誤次數。次日用學習完成的小鼠再次進行跳臺測試，根據2次跳臺回避錯誤次數的實驗數據分析各組小鼠的記憶保持能力。

2.3 給藥

給藥組小鼠在造模后15 d起分別頸部皮下注射高、中、低劑量的PM和ED，注射標準為0.1 mL/10 g，持續給藥15 d；正常對照組和衰老模型組小鼠注射等量生理鹽水，持續處理15 d。給藥后采用行為學實驗檢測小鼠學習記憶能力的變化。

2.4 Western Blot法檢測小鼠海馬體組織中ChAT、AChE蛋白表達量變化

跳臺行為學檢測后，頸椎脫臼法處死小鼠，快速取海馬體，分別保存于3 mL EP管中，-20 ℃暫存。在冰上用細胞裂解液(質量體積比W/V=1∶9)分別將小鼠海馬體組織研磨，冰上裂解30 min后，4 ℃13 000 r·min-1離心25 min，取上清，暫存于-20 ℃，用于Western Blot實驗。

Western Blot法如前期工作文獻(Yangetal.，2014)描述。用BCA法測定蛋白濃度，對提取的海馬組織總蛋白進行蛋白定量。將每個樣品的蛋白濃度調成一致，用10%的SDS-PAGE分離蛋白質，半干法轉膜(PVDF膜)，5%的奶粉封閉液封閉30 min，一抗(1∶1 000)孵育過夜(4 ℃)，TBST洗3～5次，每次10 min，室溫下二抗(1∶2 000)孵育1 h，TBST洗3～5次，每次10 min。加化學發光液后在化學發光成像儀Tanon 4200中檢測目的蛋白質的表達量并拍照。實驗結果以實驗組目的蛋白灰度值與正常對照組β-actin灰度值的比值進行統計分析。

2.5 數據統計學處理

3 實驗結果

3.1 亞急性衰老模型小鼠的建立

與正常對照組相比，各實驗組小鼠跳臺實驗回避錯誤次數顯著增加(P<0.001)。AlCl3灌胃和D-Gal皮下注射引起了小鼠的學習記憶能力的障礙，表明亞急性衰老模型小鼠造模成功(圖1)。

圖1 正常對照組與實驗組小鼠跳臺回避錯誤次數

###實驗組小鼠回避錯誤次數極顯著高于正常對照組，P<0.001。

###compared with control group， the number of avoidance errors of treatment group is extreme significantly different，P<0.001.

3.2 PM對亞急性衰老模型小鼠學習記憶能力的影響

跳臺實驗結果顯示：與正常對照組比較，衰老模型組小鼠的跳臺回避錯誤次數明顯增加(P<0.05)；與衰老模型組比較，ED陽性對照組和H-PM組、M-PM組、L-PM組的跳臺回避錯誤次數明顯減少(P<0.05或P<0.001)，而H-PM組、M-PM組和L-PM組與ED陽性對照組的跳臺回避錯誤次數相近(P>0.05)，說明PM能夠改善亞急性衰老模型小鼠的學習記憶能力障礙(表1)。

表1 何首烏苷對小鼠跳臺回避錯誤次數的影響

注： 與正常對照組比，*P<0.05； 與衰老模型組比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。

Notes： compared with the normal control group，*P<0.05； compared with the model group，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001.

3.3 PM對亞急性衰老模型小鼠海馬體組織細胞內ChAT表達的影響

與正常對照組相比，衰老模型組小鼠海馬體組織細胞內ChAT的表達量極顯著下降(P<0.001)。給藥后，M-PM組、H-PM組與ED陽性對照組較衰老模型組ChAT的表達量明顯上升，差異有高度統計學意義(P<0.01或P<0.001)；L-PM組與衰老模型組的差異無統計學意義。說明亞急性衰老模型小鼠海馬體組織細胞ChAT表達量明顯下降，而中、高劑量的PM能夠恢復海馬體ChAT的活性，促進膽堿能神經元合成ACh，從而改善膽堿能系統(圖2)。

圖2 Western Blot檢測各組小鼠海馬組織ChAT的表達量

與正常對照組比較，***P<0.001； 與衰老模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；n=3； 下同。

Compared with the control group，***P<0.001； compared with the model group，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；n=3； the same below.

圖3 Western Blot檢測各組小鼠海馬組織AChE的表達量

3.4 PM對亞急性衰老模型小鼠海馬體組織細胞內AChE表達的影響

與正常對照組相比，衰老模型組小鼠海馬體組織細胞內AChE的表達量極顯著增加(P<0.001)；給藥后，L-PM組、M-PM組、H-PM組與ED陽性對照組較衰老模型組AChE的表達量明顯減少，差異有統計學意義或高度統計學意義(P<0.05，P<0.01或P<0.001)。說明亞急性衰老模型小鼠海馬體組織細胞AChE表達量明顯上升，ACh破壞顯著，而PM能夠抑制AChE的活性，減少ACh的破壞，改善膽堿能系統損害(圖3)。

4 討論

由于老年癡呆癥的病因、發病機理未明，尚無根治藥物。研究發現老年癡呆癥患者大腦有大量的鋁沉積，含量是正常人的數倍，并能引起大腦神經纖維病變、膽堿能神經系統功能障礙，因此推測鋁與老年癡呆癥的發病密切相關，也成為老年癡呆發病的重要發病機制之一。為此提出老年癡呆癥的鋁中毒學說，用鋁(如AlCl3)來復制老年癡呆癥的病理模型(馬允等，2005；王昱等，2015)。D-Gal可造成小鼠亞急性衰老早有報導(孫榮花等，2015)。動物長期注射D-Gal后，由于代謝產物半乳糖醇不能被進一步代謝而堆積在細胞內，導致細胞代謝紊亂，活性氧增多和細胞膜脂質受損，以致機體多器官、多系統功能衰退，這些現象均與老齡化非常相似。

D-Gal聯合AlCl3造成小鼠亞急性衰老，引起神經元的一系列退行性改變，包括神經元數量減少、超氧化物歧化酶活性下降、丙二醛和脂褐素水平升高、腦內ACh含量明顯下降、ChAT表達下降(Xiaoetal.，2011；王昱等，2015)。故本實驗選擇了AlCl3灌胃聯合D-Gal頸部皮下注射60 d的處理來建立亞急性衰老小鼠模型，以模擬老年癡呆癥的病理模型，并通過跳臺逃避行為學實驗來驗證造模是否成功。實驗結果顯示，實驗組學習記憶能力較正常對照組明顯下降，說明模型建立成功。治療后，各給藥組與衰老模型組比較學習記憶能力明顯改善，表明PM與ED具有相同的抗衰老功能，可改善亞急性衰老模型小鼠的學習記憶能力。

另一方面，本研究發現D-Gal聯合AlCl3方法建模成功的疾病模型動物，治療前和治療結束后的跳臺回避錯誤次數出現了較大的組間差異。D-Gal聯合AlCl3建模方法雖然是目前普遍使用的一種方法，但是該方法的有效性和持久性可能還存在一定的局限性。實驗結束后，除各給藥組外，對照組小鼠的跳臺回避錯誤次數也出現了顯著的組間差異，提示可能是小鼠在中斷D-Gal和AlCl3處理后機體對神經組織的損傷進行了自身修復或者是小鼠對刺激產生了記憶。對于上述推測，本課題組將會設計實驗進一步驗證，探究D-Gal聯合AlCl3造模方法的局限性和改進方式。

大腦學習記憶和認知能力與膽堿能神經系統密切相關，ACh是此系統重要的神經傳導介質，它由ChAT催化合成，釋放后作用于AChRs，之后被AChE催化分解。多數研究表明，AD患者新皮質和海馬區域中ChAT表達或活性明顯減低，而AChE表達或活性升高，造成ACh含量明顯下降，使學習記憶、認知能力減退，且與認知障礙程度密切相關(Ikonomovicetal.，2007；Karranetal.，2011；Lietal.，2012；仇淑君等，2014)。因此檢測AD小鼠模型海馬組織內ChAT和AChE含量，可以評估中樞膽堿能系統的損害情況。實驗結果顯示，亞急性衰老模型小鼠海馬體組織細胞內ChAT明顯降低而AChE含量顯著上升。藥物干預后，AChE含量顯著下降而ChAT明顯升高，表明PM能夠提高ChAT的表達而抑制AChE的活性，恢復海馬體膽堿能神經元內合成酶的表達和活性，促進膽堿能神經元的修復，從而改善學習記憶和認知能力。

綜上所述, PM可改善D-Gal聯合AlCl3造模形成的亞急性衰老模型小鼠的學習記憶能力，并顯著升高腦內ChAT含量、降低AChE水平，恢復ACh含量，這可能是防治AD的機制之一。

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The Effect ofPloygonummultiflorumThunb. Glycoside on Learning and Memory and Expression of ChAT and AChE in the Hippocampus of Subacute Aging Model Mice

YU Yun1， 2#， WANG Baili1， 3#， ZHANG Yu1， 2#， ZHAO Yu1， 2*， QIN Xiaoyan1， 2*

(1. College of Life & Environmental Science， Minzu University of China， Beijing 100081， China； 2. Beijing Engineering Research Center of Food Environment and Health， Minzu University of China， Beijing 100081， China； 3. The School Hospital Clinical Laboratory， Minzu University of China， Beijing 100081， China)

Objective This study aims to investigate the potential protective effect ofPloygonummultiflorumThunb. glycoside (PM) on the ability of learning and memory and the regulatory function on the expression of ChAT and AChE in the hippocampus of subacute aging mice model. Methods Kunming (KM) mice were treated by AlCl3(10 mg·kg-1)via intragastric administration (Ig) and D-glactose (120 mg·kg-1) via subcutaneous injection on neck for 60 days. The qualified individuals were screened by jumping-out experiment. Male and female qualified mice were equally divided into6 groups， including normal control group, disease model group (negative control)， estradiol positive group (10 mg·kg-1)， PM-high dose (80 mg·kg-1)， PM-medium dose (40 mg·kg-1) and PM-low dose (20 mg·kg-1) groups. Negative control was treated by saline buffer； healthy mice treated by saline buffer were used as normal control. KM mice were treated by PM or estradiol via subcutaneous injection on neck for 15 days since the 15th day after the model was established. The learning and memory ability of mice in each group was determined by the jumping-out experiment. ChAT and AChE protein expression in the hippocampus tissue were detected by Western Blot assay. Results Compared with normal control group， the learning and memory ability of mice decreased in the treatment group， and the number of avoidance errors was significantly increased (P<0.05). Compared with the disease model group， the learning and memory ability of mice treated by designated dose of PM and estradiol was significantly improved， and the number of withdrawal avoidance errors was obviously or extreme obviously decreased (P<0.05 orP<0.001). However， the data of estradiol positive group was similar with those of PM treatment groups (P>0.05). Compared with the disease model group， the expression of ChAT and AChE was down-regulated in the hippocampus of groups treated by PM in different dose or estradiol (P<0.05 orP<0.001). Conclusion PM can effectively improve the learning and memory ability of the subacute aging model mice. The mechanism is related with the increased level of ACh in the hippocampus which can protect the cholinergic system.

PolygonummultiflorumThunb. glycoside； subacute aging model mice； learning and memory； ChAT； AChE

2016-10-09 接受日期：2016-11-16

國家自然科學基金項目(31372225)； 中央高校自主科研基金項目(2016SHXY01)； 社會醫學學術團隊建設項目(2015MDTD13C)； 北京市大學生創新項目(URTP2015110019)

俞云(1993—)， E-mail：yuyun2012446075@139.com； 汪佰莉(1979—)， E-mail：13811636247@163.com； 張雨(1993—)， E-mail：2112015746@qq.com#共同第一作者

*通信作者Corresponding author， E-mail：zhaoyu198387@gmail.com； bjqinxiaoyan@muc.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.201600272

Q95-33

A

1000-7083(2017)01-0048-06