膠紅酵母菌降解毒死蜱發酵工藝研究

梁金鐘，梅劍秋，王翼雪

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076）

膠紅酵母菌降解毒死蜱發酵工藝研究

梁金鐘，梅劍秋，王翼雪

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076）

為提高膠紅酵母菌RM-DY21對有機磷農藥的降解率，以YPD培養基為基礎培養基進行碳源、氮源及培養條件優化。利用單因素和Box-Behnken響應曲面分析，確定了膠紅酵母菌RM-DY21優化培養基配方為乳糖15 g/L，硫酸銨25 g/L，酵母浸粉10 g/L；膠紅酵母菌RM-DY21降解有機磷農藥的最佳培養條件為初始pH值5，培養溫度30℃，培養時間36 h。利用優化后的發酵條件進行培養，結果顯示膠紅酵母菌RM-DY21對有機磷農藥的降解率達到83.86%，比優化前提高了10.62%。

膠紅酵母菌；培養基；發酵條件；優化

近年來，有機磷農藥（OPs，Organophosphate，Organophosphorus Pesticides）以其高效、廣譜、中等毒性等特點替代了有機氯而成為農業生產中使用最為廣泛的一類農藥，被廣泛用于水稻、果樹、蔬菜等糧食和經濟作物中蟲害的防治中[1]。據報道，我國農產品中農藥殘留超標率達20%左右[2]，這些農藥的殘留不僅影響食品安全，而且給人類健康和生態系統帶來極為嚴重的不良后果，危害著人們的生命安全和身體健康。

微生物降解有機磷農藥殘留是解決有機磷農藥污染的一條重要途徑[3]，也被認為是降解有機磷農藥最可靠、最高效的途徑[4-6]。國內外傾向于用生物的方法解決有機磷農藥引發的問題，使用生物修復法消除有機磷農藥的污染。目前，國內外對于降解有機磷農藥的細菌研究較多，真菌的研究還處于初步階段[7-11]。真菌與細菌相比，具有遺傳性狀穩定、生存能力強、抗逆性強、耐高溫、生物量大等優點[12]。

試驗以誘變后的膠紅酵母菌為出發菌株，以毒死蜱為降解底物進行降解試驗，從培養基的優化、發酵條件優化方面進行研究，確定了優化培養基配方和適宜的培養條件，為下一步對菌種產酶試驗的進一步研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠紅酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa），哈爾濱商業大學發酵工程實驗室保藏；毒死蜱乳油（50 g/100 mL），浙江新農化工股份有限公司提供；石油醚，天津市富宇精細化工有限公司提供。

1.2 儀器與設備

JPT型分析天平，江蘇常州儀器廠產品；DZP-102型恒溫振蕩器，中國哈爾濱東聯恒溫電子技術開發有限公司產品；5100型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產品；723N型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產品；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋，上海中安醫療機械廠產品；BCN-1360B型超凈工作臺，蘇州順鑫凈化科技有限公司產品。

1.3 培養基

1.3.1 基礎培養基[13]（YPD培養基）

葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸餾水配制，于121℃條件下滅菌15 min，固體培養基加瓊脂20 g/L。

1.3.2 發酵培養基[14]

在基礎培養基中加入25 mg/L毒死蜱農藥，蒸餾水配制，于121℃條件下滅菌15 min，固體培養基加瓊脂20 g/L。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化

在無菌條件下，將保存于固體斜面上的菌種挑取1環劃線到基礎固體培養基中，于28℃恒溫培養箱中培養24～48 h，長出單菌落后挑取單菌落進行鏡檢，確定其純度；然后將菌種接種到液體基礎培養基中擴大培養，如此活化2～3次，作為后續試驗備用菌液。

1.4.2 紫外分光光度法測定有機磷農藥的殘留量

在發酵培養基中接菌，在其中取發酵液再加入等體積的石油醚，將其放入空氣浴振蕩器中以轉速150 r/min振蕩10 min，以石油醚作為參比，在紫外可見分光光度計中測OD293值，并以毒死蜱濃度為橫坐標（X）、毒死蜱于波長293 nm處吸光度為縱坐標（Y）繪制標準曲線。

1.4.3 有機磷農藥降解率的計算

式中：X——農藥的生物降解率，%；Cx——接菌處理培養液中農藥質量濃度，mg·L-1；Cck——未接菌對照培養液中農藥質量濃度，mg·L-1。

1.4.4 菌株RM-DY21生長與降解曲線的測定

將菌株RM-DY21接種于發酵培養基中，每隔2 h取樣，分別用紫外分光光度法測培養基中的毒死蜱殘留量，以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制菌株的生長曲線與降解曲線。

1.5 不同培養基成分及含量對菌株降解有機磷農藥的影響

1.5.1 不同碳源及其添加量對菌株降解有機磷農藥的影響

將發酵培養基中的碳源除去，分別選擇20 g/L葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉、果糖添加到發酵培養基中，按照2.0%接種量接種后于28℃，150 r/min的搖床中恒溫振蕩培養48 h，研究不同碳源對菌株生長及降解有機磷農藥的影響。在確定了最適碳源基礎上，分別調節最適碳源添加量10，20，30，40，50 g/L，考察其質量濃度對菌株生長和降解有機磷農藥的影響，確定最適碳源質量濃度。

1.5.2 不同氮源及其添加量對菌株降解有機磷農藥的影響

將發酵培養基中的氮源除去，分別選擇20 g/L胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉作為氮源添加到發酵培養基中，提供菌株生長需要唯一氮源。按照2.0%接種量接種后于28℃，150 r/min搖床中恒溫振蕩培養48 h，研究不同氮源對菌株生長及降解有機磷農藥的影響。在確定了最佳氮源基礎上，分別調節最適氮源濃度為10，15，20，25，30 g/L，考察其濃度對菌株生長和降解有機磷農藥的影響，確定最適氮源濃度。

1.6 培養條件優化

1.6.1 初始pH值對菌株生長及有機磷農藥降解率的影響

在發酵培養基中，分別調節初始pH值為3，4，5，6，7。按照2%接種量接種后于28℃，150 r/min恒溫振蕩培養箱中培養48 h，通過測定菌體生長量及有機磷農藥降解率確定最佳初始pH值。

1.6.2 培養溫度對菌株生長及有機磷農藥降解率的影響

在發酵培養基中，選擇上述最佳初始pH值，按2.0%接種量接種種子液于液體培養基中，培養溫度分別為26，28，30，32，34℃，置于轉速150 r/min恒溫振蕩培養箱中培養48 h，通過測定菌體生長量及有機磷農藥降解率確定最佳培養溫度。

1.6.3 培養時間對菌株生長及有機磷農藥降解率的影響

在發酵培養基中，選擇上述最佳初始pH值及最佳培養溫度，按2%接種量接種種子液于液體培養基中，以轉速150 r/min于恒溫振蕩培養箱中培養，每隔2 h測定菌株對有機磷農藥的降解率，從而確定最佳培養時間。

1.6.4 響應面分析法優化菌株降解有機磷農藥的條件

綜合單因素試驗結果，利用Design Expert 7.0軟件進行響應面設計，并對所得數據進行多元回歸擬合及方差分析，得到菌株降解有機磷農藥最佳條件培養方案。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

毒死蜱紫外分光光度計定量標準曲線見圖1。

由圖1可知，在0～200 mg/L范圍內有良好的線性關系，回歸方程為Y=0.002 18X+0.006 5，相關系數為R2=0.999 11。

圖1 毒死蜱紫外分光光度計定量標準曲線

2.2 菌株RM-DY21的生長曲線

菌株RM-DY21的生長曲線見圖2。

圖2 菌株RM-DY21的生長曲線

由圖2可知，在基礎培養基中菌株RM-DY21適應期長、生長緩慢，38 h后生長趨勢相對穩定。

2.3 不同碳源和氮源對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

2.3.1 不同碳源對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

在基礎液體培養基中，以25 mg/L毒死蜱質量濃度的發酵培養基為基礎，選擇葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、淀粉6種碳源，質量濃度均為20 g/L，按2%接種量接種于液體培養基中，培養溫度28℃，置于150 r/min的搖床恒溫培養36 h，測其菌體生長量與降解率；再選取最佳碳源分別配制10，15，20，25，30 g/L的發酵培養基，發酵培養并測其菌體生長量與有機磷農藥降解率。

不同碳源對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響見圖3，不同乳糖添加量對菌株RMDY21降解有機磷能力及菌體生長的影響見圖4。

圖3 不同碳源對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

圖4 不同乳糖添加量對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

由圖3可知，乳糖對菌株生長影響效果最好，麥芽糖、果糖和葡萄糖次之；乳糖對毒死蜱的降解影響效果最佳，麥芽糖次之。認為菌株利用雙糖生長較好，易于利用，大都能有效參與酶合成，而對于蔗糖和可溶淀粉利用率低。綜合考慮菌株生長與毒死蜱降解的影響效果，選取乳糖為最佳碳源。然后對于乳糖的不同添加量進行優化試驗（如圖4），得到乳糖添加量為15 g/L時降解率達到最高，菌體生長量也較高，當乳糖添加量繼續增大，由于滲透壓的升高，抑制了菌落的生長與繁殖，菌體生長量下降。故選15 g/L為乳糖最適添加量。

開展思想政治引領工作對于高職院校而言，應當從以下四個方面入手，形成從理論宣傳和思想疏導，從生活實際到網絡環境的全面倡導。幫助學生從各個方面感受到關懷，逐步培養并堅定自身的正確思想政治觀念和體系。

2.3.2 不同氮源對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

在基礎液體培養基基礎上，以25 mg/L毒死蜱質量濃度的發酵培養基為基礎，選擇酪蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉6種氮源，質量濃度均為20 g/L，按2%接種量接種于液體培養基中，培養溫度28℃，置于搖床恒溫培養36 h，轉速為150 r/min，測其菌體生長量與有機磷農藥降解率；再選取最佳氮源分別配制10，15，20，25，30 g/L的發酵培養基，發酵培養并測其菌體生長量與有機磷農藥降解率。

不同氮源對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響見圖5，不同硫酸銨添加量對菌株RMDY21降解有機磷能力及菌體生長的影響見圖6。

圖5 不同氮源對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

由圖5可知，酪蛋白胨、大豆蛋白胨和硫酸銨對菌體生長的促進作用高于硝酸鈉，而硫酸銨對毒死蜱的降解效果顯著高于其他氮源。因此，綜合考慮忽略次要指標菌體生長量，選取對毒死蜱降解效果最好的硫酸銨進行優化。由圖6可知，硫酸銨為25 g/L時，降解率達到最高值；繼續增大添加量使得培養基內環境發生改變，抑制菌體產酶活性，從而影響其對毒死蜱的降解效果。故選擇25 g/L作為硫酸銨的最適添加量。

圖6 不同硫酸銨添加量對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

2.4 培養條件對菌體生長及有機磷農藥降解率的影響分析

2.4.1 培養時間對菌體生長及有機磷農藥降解率的影響

在液體發酵培養基中，選擇上述最佳初始pH值、培養溫度。按2.0%接種量接種種子液于液體培養基中，置于搖床恒溫培養24，36，48，60，72 h，轉速為150 r/min，發酵培養后取樣，分別測得菌體生長量與有機磷農藥降解率。

圖7 不同培養時間對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

由圖7可知，隨著培養時間的增加，菌體生長量和降解率均逐步提高，可推測該菌株的產酶為同步合成型，即在生長初期菌株便開始產酶，伴隨著菌株的生長，產酶量逐漸上升，到達穩定期時產酶停止。

當培養時間到達36 h時，降解率達到最高；隨著培養時間的繼續增加，降解率基本保持平穩略有降低。因而，36 h為最佳培養時間。

2.4.2 不同初始pH值對菌體生長及有機磷農藥降解率的影響

不同初始pH值對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響見圖8。

圖8 不同初始pH值對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

在液體發酵培養基中，選擇初始pH值分別為3，4，5，6，7，按2%接種量接種種子液于發酵培養基中，培養溫度28℃，置于搖床恒溫培養36 h，轉速為150 r/min，發酵培養后取樣，分別測得菌體生長量與有機磷農藥降解率。

發酵液適宜的pH值環境對菌體生長及產酶條件具有一定的促進作用。由圖8可知，在初始pH值為6時菌株生物量達到最高，而菌體降解有機磷農藥的最適初始pH值為5，由于優先考慮降解效率，故選初始pH值為5。

2.4.3 培養溫度對菌體生長及有機磷農藥降解率的影響

在液體發酵培養基中，選擇上述最佳初始pH值，按2%接種量接種種子液于液體培養基中，培養溫度分別為26，28，30，32，34℃，置于搖床恒溫培養36 h，轉速為150 r/min，發酵培養后取樣，分別測得菌體生長量與有機磷農藥降解率。

不同培養溫度對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響見圖9。

圖9 不同培養溫度對菌株RM-DY21降解有機磷能力及菌體生長的影響

由圖9可知，培養過程中培養溫度對于菌體生長的影響并不顯著，但對毒死蜱的降解效果具有一定的影響。由于培養溫度是影響酶活力的重要指標，從而影響了菌株對有機磷農藥的降解率。在30℃時菌體的生長與毒死蜱的降解都達到最優值，故選擇30℃作為最佳培養溫度。

2.5 響應面分析優化菌株降解有機磷農藥的條件

2.5.1 響應曲面設計及結果分析

根據Box-Behnken原理，綜合單因素試驗結果，選取3個對菌株降解有機磷農藥影響顯著的因素，分別為初始pH值（A）、培養時間（B）、培養溫度（C）為自變量，以有機磷農藥降解率為響應值進行三因素三水平響應曲面設計試驗。

響應面試驗因素與水平設計見表1，響應面試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素與水平設計

表2 響應面試驗設計及結果

對初始pH值（A）、培養時間（B）、培養溫度（C） 進行中心組合設計，利用Design Expert 8.0軟件對表2中數據進行多元回歸擬合得到二次回歸方程為：

降解率（%）=82.70-1.29A+0.94B+0.97C+ 0.37AB-1.21AC+1.79BC-11.96A2-6.32B2-7.61C2.

按此回歸方程建立響應值的方差分析表，對響應值的顯著性進行分析來驗證回歸模型及試驗結構的有效性。

響應面二次回歸方程方差分析見表3。

該回歸方程的相關系數R2=0.998 4，表明回歸方程的擬合良好，與試驗結果有99.84%的符合度；修正系數為R2adj=0.996 3，說明該模型具有較高的可信度。因此，可用該模型分析預測膠紅酵母菌對有機磷農藥的降解率。

表3 響應面二次回歸方程方差分析

對二次多項回歸模型進行方差分析（見表3）。模型p＜0.000 1，模型的F值為480.81，說明該模型顯著；其中A，B，C，AC，BC，A2，B2，C2對菌體生長量影響顯著；失擬項F值為0.49，表明失擬項對純誤差不顯著，說明模型符合實際。各因素中一次項（A，B，C）、二次項（A2，B2，C2）及交互項（AC，BC）的p值均＜0.05，說明其對響應值影響顯著；模型失擬項p值0.708 2＞0.05，從另一方面說明模型具有良好的擬合度。

2.5.2 響應曲面圖形分析

由表3可知，初始pH值、培養溫度、培養時間均為影響菌株RM-DY21對有機磷農藥降解率的主要因素。

不同初始pH值與培養時間對降解率影響的響應曲面與等高線見圖10，不同初始pH值與培養溫度對降解率影響的響應曲面與等高線見圖11，不同培養時間與培養溫度對降解率影響的響應曲面與等高線見圖12。

等高線密集且越趨向橢圓形表示兩因素交互作用顯著，反之則表示交互作用不顯著。通過等高線圖得到最優條件下各試驗因子取值，圖10和圖12等高線越密集且越趨向橢圓形表明兩因素交互作用明顯，圖10中等高線相對較圓說明交互作用不明顯，該結果與表3方差分析結果一致。

通過 Design Expert 8.0軟件優化后得到菌株RM-DY21對有機磷農藥降解的最優條件為初始pH值4.94，培養溫度30.16℃，培養時間36.34 h，預測降解率可達82.81%。按為試驗方便可行，將最優條件修正為初始pH值為5，培養溫度30℃，培養時間36 h。在優化后的培養條件下進行培養，確定模型與試驗的相符性，得到實際降解率為83.86%。實際的降解率與回歸方程接近，證明模型的可行性。

圖10 不同初始pH值與培養時間對降解率影響的響應曲面與等高線

圖11 不同初始pH值與培養溫度對降解率影響的響應曲面與等高線

圖12 不同培養時間與培養溫度對降解率影響的響應曲面與等高線

3 結論

通過單因素試驗，選出膠紅酵母菌對有機磷農藥降解率最佳碳源為乳糖，添加量為15 g/L；最佳氮源為硫酸銨，添加量為25 g/L；培養條件的最佳初始pH值為5，最佳培養溫度為30℃，最佳培養時間為60 h。在單因素試驗的基礎上選取培養溫度、培養時間和初始pH值為試驗因素，以降解率為響應值，通過Box-Behnken的中心組合設計及響應面法對菌株RM-DY21降解有機磷農藥發酵條件進行了優化，建立了菌株對有機磷農藥降解條件的二次多項式模型，確定最佳條件為初始pH值5，培養溫度30℃，培養時間36 h，菌株對有機磷農藥的降解率為82.81%。經顯著性檢驗證明，此條件下菌株對有機磷農藥的降解率為83.86%，與理論值相差1.05%，表明應用響應曲面法優化菌株RM-DY21降解有機磷農藥的條件是可行的，證明該模型具有可靠性。為后續菌株產酶研究的相關試驗奠定了良好的基礎。

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Optimization Fermentation of Rhodotorula mucilaginosa for Chlorpyrifos Degradation

LIANG Jinzhong，MEI Jianqiu，WANG Yixue

（Heilongjiang Key Laboratory of Food Science and Engineering，School of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

Rhodotorula mucilaginosa are cultured for the degradation of organic phosphorus pesticide.To improve the degradation rate of organic phosphorus，carbon source，nitrogen source and fermentation conditions are optimized in YPD culture medium.With the results of single factor and Box-Behnken analysis，the optimum culture medium is as follows：lactose 15 g/L，ammonium sulfate 25 g/L，yeast extract 10 g/L and optimal culture conditions are as follows：initial pH 5，fermentation temperature 30℃，fermentation time 36 h.In the optimized medium，organic phosphorus pesticide degradation rate of Rhodotorula mucilaginosa reached to 83.86%which is 10.62%higher than that without optimization.

Rhodotorula mucilaginosa；medium；fermentation conditions；optimization

TQ920

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.013

1671-9646（2017）01a-0045-06

2016-11-03

梁金鐘（1957— ），男，本科，教授，研究方向為微生物學與發酵工程。