大腸癌組織MAL mRNA、蛋白表達(dá)及其啟動子甲基化狀態(tài)研究

吳小昌 童國俊 謝平

大腸癌組織MAL mRNA、蛋白表達(dá)及其啟動子甲基化狀態(tài)研究

吳小昌 童國俊 謝平

目的 探討MAL基因?qū)Υ竽c癌篩查及早期診斷的價值。方法選取10例正常大腸組織作為對照，應(yīng)用RT-PCR、甲基化特異性PCR、Western blot方法分別檢測并比較大腸癌組織（40例）及相應(yīng)癌旁組織（40例）中MAL mRNA、蛋白的表達(dá)情況以及MAL基因啟動子甲基化狀態(tài)。結(jié)果大腸癌組織中MAL mRNA、蛋白的表達(dá)陽性率（10.0%、20.0%）均低于其在癌旁組織（75.0%、85.0%）和正常大腸組織（100.0%、100.0%）中的表達(dá)陽性率（均P＜0.05），而大腸癌組織中MAL基因啟動子甲基化率（90.0%）均高于其在癌旁組織（40.0%）和正常大腸組織（0.0%）中的甲基化率（均P＜0.05）。結(jié)論大腸癌組織中MAL基因或可作為大腸癌篩查及早期診斷的高潛力分子標(biāo)志物。

大腸癌 MAL基因 抑癌基因 DNA甲基化

大腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，早期診斷對其預(yù)后影響重大。目前，分子生物學(xué)檢測是研究大腸癌篩查及早期診斷的熱點[1]。研究表明MAL基因表達(dá)缺失和人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，在乳腺癌、腎癌、卵巢癌、口腔癌及子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤組織中都檢測到MAL基因啟動子呈高度甲基化狀態(tài)[2]。本研究應(yīng)用RTPCR、甲基化特異性PCR（MSP）、Western blot方法檢測大腸癌組織、其癌旁組織及正常大腸組織中MAL mRNA、蛋白的表達(dá)情況以及MAL基因啟動子甲基化狀態(tài)，探討MAL基因在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能所起的作用，以期為大腸癌篩查和早期診斷的研究提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 大腸癌組織（40例）、癌旁組織（40例），正常成人大腸組織（10例）皆取自本院外科住院患者。其中大腸癌組織、癌旁組織取自大腸癌手術(shù)切除的標(biāo)本，癌旁組織為對應(yīng)的距癌腫10cm以上結(jié)腸組織；正常成人大腸組織來自行吻合器痔環(huán)切術(shù)切除的標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受放、化療及其他抗癌治療，標(biāo)本切除后立即于-80℃冰凍保存用于下一步實驗。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并經(jīng)患者及家屬知情同意。

1.2 試劑和儀器 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司, DNA抽提試劑盒購自天根公司，DNATaq聚合酶、TEMED、DNA純化回收系統(tǒng)（A7280）購自美國Promega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，1∶100兔抗人MAL多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物科技有限公司，1∶100兔抗人β-actin多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京中衫金橋生物技術(shù)公司，蛋白抽提試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司，基因甲基化一步法檢測試劑購自美國Genmed公司。主要儀器為德國Eppendorf公司PCR擴(kuò)增儀、美國BIO-RAD公司半干式轉(zhuǎn)移電泳裝置及電泳儀等。

1.3 MAL基因引物序列及擴(kuò)增條件 RT-PCR：正向引物序列5′-AAGATCCTCTGCTGACCCCT-3′，反向引物序列5′-ACCATGGACCTCTGGAAAGA-3′，擴(kuò)增片段166bp。β-actin基因：正向引物序列5′-ACGTTGCTATCCAGGCTGTG-3′，反向引物序列5′-AATGTCACGCACGATCGATTCC-3′，擴(kuò)增片段239bp，在實驗中用作內(nèi)參照。MSP：Methylated（甲基化）正向引物序列5′-TTCGGGTTTTTTTGTTTTTATTC-3′，反向引物序列5′-GAAAACCATAACGACGTACTAACGT-3′，擴(kuò)增片段139bp。Unmethylated（未甲基化）正向引物序列5′-TTTTGGGTTTTTTTGTTTTTAATTT-3′，反向引物序列5′-ACAAAAACCATAACAACATACTAACATC-3′，擴(kuò)增片段142 bp。引物由上海申能博彩生物工程技術(shù)公司合成。RT-PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min，（94℃30s，56℃30s，72℃30s）共35循環(huán)，72℃延伸7min；MSP循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性 5min，（94℃ 30s，56℃ 30s，72℃30s）共35循環(huán),72℃延伸7min。

1.4 實驗方法 （1）RT-PCR：采用Trizol法抽提組織mRNA，實驗步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。紫外分光光度計檢測mRNA的濃度和純度，A260/A280在1.8～2.0間的mRNA入選進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以兩步法行RT-PCR。取PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像儀掃描、拍照，用軟件分析各條帶灰度值，以目的基因與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示其相對含量（MAL擴(kuò)增片段166bp，β-actin擴(kuò)增片段239bp，若灰度值比值≥1則視為MAL mRNA表達(dá)陽性）。（2）Western blot：從各種組織中提取總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，12%的分離膠分離MAL蛋白，電泳后采用半干式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，膜用5%的脫脂牛奶37℃封閉1h，加入一抗MAL抗體（1∶1 000），37℃孵育1h,加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶1 000），37℃孵育1h,β-actin單克隆抗體（1∶100）作為內(nèi)參照，孵育3h，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測雜交信號（17KD附近出現(xiàn)特異性條帶，則視為MAL蛋白表達(dá)陽性）。（3）MSP：酚一氯仿法提取基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，DNA純化系統(tǒng)對修飾后的DNA標(biāo)本進(jìn)行純化，再次堿變性后乙醇沉淀，溶解后用于PCR擴(kuò)增模板。PCR產(chǎn)物加于2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，0.1%EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相分析（甲基化擴(kuò)增片段139bp，非甲基化擴(kuò)增片段142 bp，若甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶，則視為MAL基因啟動子發(fā)生甲基化）。

1.5 觀察指標(biāo) 觀察比較大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL mRNA、蛋白表達(dá)情況及其啟動子甲基化狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件；計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL mRNA表達(dá)情況比較 大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL mRNA表達(dá)電泳圖見圖1。

圖1 大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL mRNA表達(dá)電泳圖（1、2：正常大腸組織；3、4：癌旁組織；5、6：大腸癌組織；1、3、5：β-actin；2、4：陽性條帶；6：陰性條帶）

由圖1可見，RT-RCR結(jié)果顯示大腸癌組織中MAL mRNA表達(dá)陽性率（10.0%，4/40）均低于其在癌旁組織（75.0%，30/40）和正常大腸組織（100.0%，10/10）中的表達(dá)陽性率（均P＜0.05）。且MAL mRNA在癌旁組織中的表達(dá)陽性率亦低于在正常大腸組織中的表達(dá)陽性率（P＜0.05）。

2.2 大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL蛋白表達(dá)情況比較 大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL蛋白表達(dá)情況電泳圖見圖2。

圖2 大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL蛋白表達(dá)情況電泳圖（1、2：大腸癌組織；3：正常大腸組織；4：癌旁組織）

由圖2可見，Western blot結(jié)果顯示正常大腸組織抗原的17KD附近有特異性條帶，15.0%（6/40）的癌旁組織特異性條帶或缺少或條帶較弱，80.0%（32/40）的大腸癌組織無特異性條帶出現(xiàn)。即大腸癌組織中MAL蛋白表達(dá)陽性率（20.0%，8/40）均低于其在癌旁組織（85.0%，34/40）和正常大腸組織（100.0%，10/10）中的表達(dá)陽性率（均P＜0.05）。且MAL蛋白在癌旁組織中的表達(dá)陽性率亦低于在正常大腸組織中的表達(dá)陽性率（P＜0.05）。

2.3 大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL基因啟動子甲基化狀態(tài)比較 大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL基因啟動子甲基化狀態(tài)比較電泳圖見圖3。

圖3 大腸癌組織、癌旁組織和正常大腸組織中MAL基因啟動子甲基化狀態(tài)比較電泳圖（1：癌旁組織；2：大腸癌組織；3：正常大腸組織；u：Unmethylated；m：Methylated；M：Maker）

由圖3可見，MSP結(jié)果顯示大腸癌組織中MAL基因啟動子甲基化率（90.0%，36/40）均高于其在癌旁組織（40.0%，16/40）和正常大腸組織（0.0%，0/10）中的甲基化率（均P＜0.05）。且MAL基因啟動子在癌旁組織中的甲基化率亦高于在正常大腸組織中的甲基化率（P＜0.05）。

3 討論

大腸癌是我國國民常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高居惡性腫瘤的前5位，且呈逐年上升趨勢。大腸癌的發(fā)病機(jī)制是研究的熱點，特別是在分子水平上對其進(jìn)行探索，如多種癌基因和抑癌基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。MAL基因是于1987年發(fā)現(xiàn)的抑制腫瘤生長的基因，MAL基因定位于2q13，含4個外顯子，其cDNA全長為1 051bpa，MAL蛋白是T淋巴細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白，腫瘤的發(fā)生可能與MAL基因啟動子高度甲基化有關(guān)[3-6]。

本研究將經(jīng)病理學(xué)檢查確診的大腸癌手術(shù)切除標(biāo)本、相應(yīng)的癌旁組織各40例，以及正常成人大腸組織10例作為研究材料，探討MAL mRNA、蛋白的表達(dá)情況以及MAL基因啟動子甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示大腸癌組織中MAL mRNA、蛋白的表達(dá)陽性率均低于其在癌旁組織和正常大腸組織中的表達(dá)陽性率，而大腸癌組織中MAL基因啟動子甲基化率均高于其在癌旁組織和正常大腸組織中的甲基化率。因而，筆者推測MAL基因在大腸癌組織中表達(dá)失常影響了正常蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而直接或間接的參與了大腸癌的發(fā)生，MAL基因啟動子甲基化可能是大腸癌發(fā)生的早期事件。

綜上所述，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制非常復(fù)雜，基因啟動子甲基化可能是腫瘤重要機(jī)制之一[6]。本研究結(jié)果顯示在大腸癌組織中，MAL基因啟動子甲基化導(dǎo)致MAL基因失活，影響MAL mRNA表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)MAL蛋白表達(dá)失常，間接導(dǎo)致大腸癌的發(fā)生、發(fā)展。當(dāng)然，確定MAL基因是否能作為大腸癌篩查的分子標(biāo)志物及其對大腸癌早期診斷的價值尚需實驗室及臨床更深入研究。

[1]馬炯,楊青蘭,鄧超金,等.結(jié)直腸腫瘤DNA甲基化標(biāo)志的篩選及診斷價值[J].中華胃腸外科,2015,18(11):1149-1153.

[2]Shahzad N,Shuda M,Gheit T,et al.The T antigen locus of Merkel cell polyomavirus downregulates human Toll-like receptor 9 expression[J].Virol,2013,87(10):13009-13019.

[5]Abdel-Rahman W M,Ruosaari S,Knuutila S,et al.Differential roles of EPS8 in carcinogenesis:loss of protein expression in a subset of colorectal carcinoma and adenoma[J].World J Gastroenterol,2012,18(7):3896-3903.

[6]滕玥,戴冬秋,沈文靜.hMLH1基因啟動子區(qū)甲基化在胃癌階段性發(fā)生發(fā)展中的作用[J].中華胃腸外科,2015,18(2):166-170.

Expression of MAL gene and status of its promoter methylation in colorectal carcinoma

Objective To investigate the expression of MAL gene and the status of its promoter methylation in colorectal cancer.MethodsThe expression of MAL mRNA and protein and status of promoter methylation in 40 samples of colorectal carcinoma and corresponding adjacent tissues were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR), Western blot and methylation specific PCR,respectively.Ten samples of normal colorectal tissue were used as controls.ResultsThe expression rates of MAL mRNA and protein in colorectal cancer tissues(10.0%,20.0%)were lower than those in adjacent tissues(75.0%,85.0%)and normal colorectal tissues(100.0%,100.0%)(allP＜0.05).The methylation rate of MAL promoter in colorectal cancer tissues(90.0%)was higher than that in adjacent tissues(40.0%)and normal colorectal tissues(0.0%)(allP＜0.05).ConclusionMAL gene is down-regulated in colorectal carcinoma,suggesting that it might be used as a molecular marker for screening and early diagnosis of colorectal cancer.

Colorectal carcinoma MAL gene Tumor-suppressor gene DNA methylation

2016-09-29）

（本文編輯：李媚）

313000 湖州市中心醫(yī)院胃腸外科（吳小昌、謝平），中心實驗室（童國俊）

吳小昌，E-mail：wuxiaochang88@sina.com