宮頸癌組織中miR-21和Stat3的表達及相關性研究

楊朝暉 章輝 顧華敏 范廣民 曹學全 王四玲 盧洪勝

宮頸癌組織中miR-21和Stat3的表達及相關性研究

楊朝暉 章輝 顧華敏 范廣民 曹學全 王四玲 盧洪勝

目的 探討微小RNA-21（miR-21）和信號轉導及轉錄活化因子-3（Stat3）在宮頸癌中的表達情況及臨床意義。方法采用實時熒光定量PCR檢測48例宮頸癌及20例正常宮頸組織中miR-21和Stat3 mRNA的表達，免疫組化Envision法檢測宮頸癌及正常宮頸組織中Stat3蛋白表達，分析miR-21和Stat3表達的相關性及其與宮頸癌患者臨床病理特征的關系。結果miR-21和Stat3 mRNA在宮頸癌組織中的表達均顯著高于正常宮頸組織（均P＜0.05），且miR-21和Stat3 mRNA的高表達呈正相關（r=0.631，P＜0.05）。Stat3蛋白在癌組織中的表達陽性率為79.17%（38/48）。Stat3的高表達和腫瘤低分化及有淋巴結轉移有關（均P＜0.05）。結論miR-21在宮頸癌中的表達升高，可能和宮頸癌的增殖、侵襲轉移有關。

宮頸癌 微小RNA 微小RNA-21 Stat3

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于乳腺癌，并且呈持續上升，嚴重威脅著女性的健康。近年來，隨著對微小RNA的基礎研究越來越多，微小RNA在宮頸癌致癌機制中的作用研究取得了積極進展。微小RNA-21（miR-21）在多種腫瘤中表達上調，但其作用機制和靶基因尚未完全明確。Cao等[1]報道微小RNA可以通過多種途徑調節信號轉導及轉錄活化因子-3（signal transducers and activators of transcription 3，Stat3）的活性，從而誘導腫瘤的發生、發展，但miR-21和Stat3在宮頸癌中的作用機制和相關性未見報道。本研究采用實時熒光定量PCR檢測48例宮頸癌組織中miR-21和Stat3的表達，免疫組化檢測Stat3蛋白的表達，分析它們之間的相關性及其與患者臨床病理特征的關系，為宮頸癌的分子診斷、評估預后及復發轉移提供新的理論依據。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2008年6月至2013年12月臺州市中心醫院婦產科行手術治療的宮頸癌患者48例，術前未行放、化療及內分泌治療，年齡28～73歲，平均（48.0± 10.975）歲。組織病理類型的判斷標準參照2003版WHO宮頸腫瘤的病理學分類。同時選取20例同期因子宮肌瘤行子宮全切術患者的宮頸組織，均經病理檢查證實為正常，患者年齡32～61歲，平均（44.5±6.653）歲。

1.2 主要試劑 Trizol試劑購自美國lnvitrogen公司，M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、oligo dT、dNTPs等購自Takara公司，引物由上海英駿生物技術有限公司合成，鼠抗人Stat3單克隆抗體及免疫組化試劑盒（PV-9000）購自北京中杉生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR檢測miR-21和Stat3 mRNA表達 取宮頸癌組織及正常宮頸組織標本，按Trizol試劑說明書提取總RNA，DEPC處理過的蒸餾水溶解。分別取宮頸癌組織及正常宮頸組織總RNA各1μg，miR-21莖環RT-PCR引物參考文獻[2]，莖環結構逆轉錄引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT TGAGTCAACATC-3′。逆轉錄反應條件為16℃30min，42℃30min，75℃15min。PCR擴增miR-21上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTT ATCAGACTGATG-3′，下游為5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，PCR產物大小67bp。PCR反應條件：95℃10min變性；95℃15s，60℃1min，40個循環。所有反應均設立3個復孔。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數即Ct值，以U6作為內參照，采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示腫瘤組織目的基因表達相對于配對的正常組織的變化倍數，其中ΔΔCt=（CtmiR-21-CtU6）腫瘤-（CtmiR-21-CtU6）正常。Stat3上游引物5′-AAG AGGCGGCAACAGATT-3′，下游引物5′-CGGTCTTGA-TGCCGAGGG-3′，反應條件及計算方法同上述。

1.3.2 免疫組化檢測Stat3蛋白的表達 采用Envision法檢測宮頸癌組織及正常宮頸組織中Stat3蛋白的表達，具體操作嚴格按照產品說明書進行。鼠抗人Stat3單克隆抗體工作濃度1∶100，抗原枸櫞酸鹽熱修復。以PBS代替一抗作陰性對照。Stat3表達以細胞質中呈不同染色程度的棕黃色顆粒為陽性，少數位于細胞核。觀察5個以上高倍視野（×400），計數不少于1 000個細胞中的陽性細胞數，陽性細胞數＜10%為陰性，≥10%為陽性。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗及方差分析，計數資料組間比較用χ2檢驗或秩和檢驗分析，相關性分析采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 宮頸癌組織中miR-21和Stat3 mRNA表達

2.1.1 宮頸癌組織與正常宮頸組織中miR-21和Stat3 mRNA表達的比較 宮頸癌組織中miR-21的mRNA相對表達量為1.0546±0.3325，正常宮頸組織中為0.4510± 0.2341；宮頸癌組織中Stat3的mRNA相對表達量為0.5256±0.1034，正常宮頸組織中為0.2048±0.0508，宮頸癌組織中兩者表達均高于正常宮頸組織，均有統計學差異（均P＜0.05）。miR-21、Stat3以及內參U6的實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線見圖1-2。

圖1 實時熒光定量PCR的擴增曲線（a：miR-21；b：Stat3；c：U6）

2.1.2 宮頸癌組織中miR-21和Stat3 mRNA的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 miR-21 mRNA的表達量與患者年齡、腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結轉移及FIGO分期均無關（均P＞0.05）。Stat3 mRNA的表達量與宮頸癌分化程度及淋巴結轉移均相關（均P＜0.01），與患者年齡、腫瘤大小及FIGO分期均無關（均P＞0.05），見表1。

2.1.3 宮頸癌組織中miR-21和Stat3 mRNA表達的相關性分析 Spearman相關分析發現，宮頸癌組織中miR-

21和Stat3 mRNA的表達呈正相關（r=0.631，P＜0.05）。

2.2 宮頸癌組織及正常宮頸組織中Stat3蛋白表達的比較 Stat3蛋白染色后出現棕黃色顆粒，主要集中在細胞質，部分在細胞核中。宮頸癌組織中Stat3蛋白表達呈強陽性（38/48，79.17%），正常宮頸組織中Stat3蛋白低表達或無表達（6/20，30.00%），兩者間比較有統計學差異（P＜0.05）。隨著腫瘤分化程度減低，Stat3蛋白表達陽性率逐漸遞增，Stat3蛋白的表達還與淋巴結轉移相關（均P＜0.05），見圖3-4和表2。

圖2 實時熒光定量PCR的熔解曲線（a：miR-21；b：Stat3；c：U6）

表1 宮頸癌組織中miR-21和Stat3 mRNA的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系

圖3 Stat3在宮頸中分化鱗狀細胞癌中的陽性表達（Envision染色，×200）

圖4 Stat3在宮頸低分化鱗狀細胞癌中的陽性表達（Envision染色，×200）

表2 宮頸癌組織中Stat3蛋白表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系[例（%）]

3 討論

近年來研究發現了一類內源性短鏈RNA，即miRNA，長度約為22nt，不編碼蛋白質，但能夠通過和靶基因mRNA部分或完全互補結合抑制其翻譯或導致其降解而起到轉錄后沉默基因表達的作用，有可能作為一種生物標記，成為惡性腫瘤治療的一個新靶點及腫瘤診斷和預后的分子標志物[3]。miR-21定位于17q23.1，具有癌基因特性，是miRNA家族中著名的癌基因，在胰腺癌及肺癌等惡性腫瘤中高表達[4-5]，并通過抑制凋亡而與腫瘤的發生及進展有關。本研究結果發現，miR-21的mRNA在宮頸癌組織中的表達量明顯高于正常宮頸組織，與文獻報道一致[6]，而在不同年齡、腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結轉移及FIGO分期的患者之間比較，其相對表達量無統計學差異。研究結果提示miR-21可能參與了宮頸癌的發生，在腫瘤形成過程中起到關鍵的調控作用[6]，而是否參與宮頸癌的侵襲和轉移尚無確切的證據。

Stat3是信號轉導與轉錄活化因子家族的重要成員，在正常組織中僅短暫表達，而在多種惡性腫瘤組織，如肝癌、乳腺癌和胃癌中呈持續性激活和高表達，并且與腫瘤的惡性程度及預后密切相關[7-8]。本研究結果顯示Stat3 mRNA和蛋白在正常宮頸組織中也有表達，在宮頸癌組織中表達增高，并且隨著宮頸癌組織分化的減低和淋巴結轉移的發生，表達水平進一步升高。隨著腫瘤向晚期進展，分化程度減低，Stat3被不斷激活，進入細胞核，發揮抑制腫瘤細胞凋亡的作用[9]。同時，可能通過誘導靶基因 Survivin、VEGF、MMP家族等的表達，促使腫瘤細胞增殖，這在其他多種腫瘤中已得到驗證[10-11]。

本研究通過對48例宮頸癌組織中的miR-21及Stat3 mRNA的相對表達量進行相關性分析，結果發現兩者呈正相關。這提示miR-21可能調控Stat3表達，抑制腫瘤凋亡，促進腫瘤發生、發展。有文獻報道Stat3可能結合miR-21的啟動子調節其轉錄[12]，但是具體如何調節尚不清楚。

另外miR-21調控的靶基因還有多種，如PDCD4、PTEN、SPRY1、SPRY2及p53等[13-15]，它們在腫瘤的發生、發展中都發揮重要作用。miR-21如何調節Stat3以及其他靶基因，這些靶基因之間是否存在相互作用，相互作用的信號通路如何，還有待進一步研究。

[1]Cao Q,Li Y Y,He W F,et al.Interplay between microRNAs and the STAT3 signaling pathway in human cancers[J].Physiol Genomics,2013,45(24):1206-1214.

[2]Tang F,Hajkova P,Barton S C,et al.MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells[J].Nucleic Acids Res,2006, 34(2):e9.

[3]Fassan M,Croce C M,Rugge M.MiRNAs in precancerous lesions of the gastrointestinal tract[J].World J Gastroenterol, 2011,17(48):5231-5239.

[5]Sicard F,Gayral M,Lulka H,et al.Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer[J].Mol Ther,2013,21(5):986-994.

[6]MotoyamaK,InoueH,Mimori K,et al.Clinicopathological and Prognostic significance of PDCD4 and microRNA-21 in human gastric cancer[J].Int J Oncol,2010,36(5):1089-1095.

[7]Sonnenblick A,Shriki A,Galun E,et al.Tissue microarray-based study of patients with lymph node-positive breast cancer shows tyrosine phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 3(tyrosine705-STAT3)is a marker of good prognosis[J].Clin Transl Oncol,2012,14(3):232-236.

[8]Xiong H,Du W,Wang J L,et al.Constitutive activation of STAT3 is predictive of poor prognosis in human gastric cancer[J].J Mol Med(Berl),2012,90(9):1037-1046.

[9] 惠慧,謝薇,吳磊,等.STAT3與Survivin在宮頸癌組織中的表達及意義[J].現代腫瘤醫學,2011,19(8):1650-1654.

[10]Wang X F,Lin G S,Lin Z X,et al.Association of pSTAT3-VEGF

signaling pathway with peritumoral edema in newly diagnosed glioblastoma:an immunohistochemical study[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(9):6133-6140.

[12]Li Y,Wu R,Liu Z,et al.Enforced expression of microRNA-21 influences the replication of varicella-zoster virus by triggering signal transducer and activator of transcription 3[J].Exp Ther Med,2014,7(5):1291-1296.

[13]Damania P,Sen B,Dar S B,et al.Hepatitis B virus induces cell proliferation via HBx-induced microRNA-21 in hepatocellular carcinoma by targeting programmed cell death protein4(PDCD4)and phosphatase and tensin homologue(PTEN)[J].PLoS One,2014,9(3):e91745.

[14]Darimipourain M,Wang S,Ittmann M,et al.Transcriptional and post-transcriptional regulation of Sprouty1,a receptor tyrosine kinase inhibitor in prostate cancer[J].Prostate Cancer Prostatic Dis,2011,14(4):279-285.

[15]Ma X,Choudhury S N,Hua X,et al.Interaction of the oncogenic miR-21 microRNA and the p53 tumor suppressor pathway[J]. Carcinogenesis,2013,34(6):1216-1223.

Expression of miR-21 and Stat3 in cervical cancer and their clinicopathological significance

Objective To investigate the expression of microRNA-21(miR-21)and Stat3 in cervical cancer and their clinicopathologic significance.MethodsStem-loop real-time RT-PCR was used to examine the expression of miR-21 and Stat3 in 48 specimens of cervical cancer and 20 specimens of normal cervical tissue.Immunohistochemistry was used to examine Stat3 protein expression in the tumor tissue.The association of miR-21 and Stat3 expression with clinicopathologic features was analyzed.ResultsThe expression of miR-21 and Stat3 in cervical cancer tissues were significantly higher than that of normal tissues(P＜0.05).The expression rate of Stat3 in cervical cancer tissue was 79.17%(38/48).The expression of miR-21 was positively correlated with Stat3(r=0.631,P＜0.05).The expression of Stat3 was correlated with lower differentiation,lymph node metastasis in cervical cancer(P＜0.05).ConclusionThe expressions of miR-21 and Stat3 are up-regulated in cervical cancer, which may be involved in the development and progression of cervical cancer.

Cervical cancerMicroRNA MicroRNA-21 Stat3

2015-08-10）

（本文編輯：胥昀）

臺州市科技局計劃項目基金（131KY14、14SF04）

318000 臺州市中心醫院（臺州學院附屬醫院）病理科