S100A9蛋白表達與宮頸鱗癌細胞侵襲、轉移的關系研究

陳苗苗 張文文 王穎 朱雪瓊

S100A9蛋白表達與宮頸鱗癌細胞侵襲、轉移的關系研究

陳苗苗 張文文 王穎 朱雪瓊

目的 探討S100A9蛋白表達與宮頸鱗癌細胞侵襲、轉移的關系。方法采用S100A9重組腺病毒轉染人宮頸鱗癌C-33A細胞，S100A9 siRNA轉染人宮頸鱗癌Caski細胞；應用Western blot檢測轉染前后2種細胞中S100A9蛋白的表達，Transwell檢測細胞侵襲與轉移能力的變化。結果轉染S100A9重組腺病毒后C-33A細胞中S100A9蛋白的表達明顯增強；與未轉染組、陰性對照組相比，轉染組C-33A細胞的穿膜細胞數、穿過小室的細胞數均明顯增多（均P＜0.05）。轉染S100A9 siRNA后Caski細胞中S100A9蛋白的表達明顯降低；siRNA組Caski細胞的穿膜細胞數、穿過小室的細胞數均明顯少于陰性對照組（均P＜0.05）。結論S100A9與宮頸鱗癌細胞的侵襲、轉移相關。上調S100A9的蛋白表達，可促進C-33A細胞侵襲與轉移的能力；下調S100A9的蛋白表達，可抑制Caski細胞侵襲與轉移的能力。

S100A9 宮頸鱗癌 侵襲 轉移

S100A9是鈣結合蛋白家族的成員之一，其在細胞的分化、增殖、凋亡和遷移中發揮著重要作用[1]。目前有相關研究結果顯示S100A9在細胞惡性轉化中亦具有重要作用，它在多種惡性腫瘤如乳腺癌[2]、卵巢癌[3]、膀胱癌[4]和未分化的甲狀腺癌[5]中表達增高，并參與腫瘤的發生、發展。我們的前期研究發現S100A9在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變（CIN）、宮頸癌中的表達逐漸升高[6]，但對宮頸癌細胞生物學行為的影響尚不明確。此外，本課題組還發現在宮頸鱗癌細胞系SiHa、C-33A、Caski和MS751中，無論是mRNA水平還是蛋白水平，S100A9在Caski細胞中的表達最高，在C-33A細胞中的表達最低（待發表）。故本研究采用轉染S100A9重組腺病毒上調宮頸鱗癌C-33A細胞S100A9的表達，利用RNA干擾技術下調宮頸癌Caski細胞中S100A9的表達，以研究S100A9蛋白表達的改變對宮頸癌細胞侵襲、轉移的影響，為宮頸鱗癌的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 人宮頸鱗癌細胞系C-33A和Caski均購于中國科學院上海細胞研究所細胞庫。DMEM、RPMI-1640培養基購于美國Gibco公司；胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司；S100A9抗體購于美國Abcam公司；S100A9 siRNA和對照siRNA購于上海吉瑪制藥技術有限公司；脂質體Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司；Matrigel購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將Caski細胞加入RPMI-1640培養基，C-33A細胞加入DMEM培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱中進行培養。2～3d換1次培養液。

1.2.2 C-33A細胞的病毒轉染 C-33A細胞以3×105/ml接種于6孔板，分為未轉染組、陰性對照組和轉染組。培養24h后，細胞融合至50%～60%，轉染組加入重組腺病毒Ad-S100A9，陰性對照組加入空載體Ad-RFP，孵育12h后，換普通培養液繼續培養36h，收集細胞進行后續實驗。未轉染組未予特殊處理。

1.2.3 Caski細胞的siRNA轉染 Caski細胞以2×105/ml接種于6孔板，培養24h后，細胞融合至30%～50%，換成無血清的培養基。將稀釋好的S100A9 siRNA（5′-CCUUGAACUCUAUCGACGUCUA-3′）與脂質體Lipofectamine 2000輕輕混勻，在室溫下放置20min。加入6孔板孵育6h后，換成完全培養基，轉染48h后收集細胞進行后續實驗，以陰性序列作為陰性對照。

1.2.4 Western blot檢測細胞S100A9蛋白的表達 收集各組細胞，用裂解液裂解、超聲處理后，采用二喹啉甲酸（BCA）法測定。經12%SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜。4℃搖床上一抗（S100A9，1∶1 000，Tubulin，1∶2 000）孵育過夜，TBST洗膜10min×3次；在辣根過氧化物酶標記的IgG二抗中室溫孵育2h，TBST洗膜10min×3次；均勻滴加曝光液于膜上后，采用Bio-Rad公司的圖像攝取系統曝光并保存圖像，測得吸光度值，即細胞S100A9蛋白的表達。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移能力 各組細胞用無血清培養基重懸后，加入Transwell上室;下室加入含10%血清的完全培養基。孵育24h后取出上室，輕輕擦去上層未穿透的細胞，多聚甲醛固定及結晶紫染色后拍照，計數穿過小孔的細胞數。

1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲能力 將Matrigel膠稀釋后鋪于上室，其余步驟同遷移實驗。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料呈正態分布，用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 轉染重組腺病毒后C-33A細胞中S100A9蛋白的表達 Western blot結果顯示，與未轉染組、陰性對照組相比，轉染 S100A9重組腺病毒后C-33A細胞中S100A9蛋白的表達明顯增強，見圖1。

圖1 轉染S100A9重組腺病毒后C-33A細胞中S100A9蛋白表達的電泳圖

2.2 轉染S100A9重組腺病毒后C-33A細胞侵襲和遷移能力的變化

2.2.1 C-33A細胞侵襲能力的變化 Transwell檢測結果顯示，未轉染組、陰性對照組和轉染組的穿膜細胞數分別為（46.40±3.65）、（46.40±2.70）和（70.40±3.85）個；與未轉染組、陰性對照組相比，轉染組穿膜細胞數明顯增多（均P＜0.05）；而未轉染組與陰性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 轉染S100A9重組腺病毒后C-33A細胞侵襲能力的變化（a：未轉染組；b：陰性對照組；c：轉染組；×400）

2.2.2 C-33A細胞遷移能力的變化 Transwell檢測結果顯示，未轉染組、陰性對照組和轉染組穿過Transwell小室的細胞數分別為（44.40±3.78）、（46.60±3.21）和（70.80±3.70）個，與未轉染組、陰性對照組相比，轉染組穿過Transwell小室的細胞數明顯增多（均P＜0.05）；而未轉染組與陰性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 轉染S100A9 siRNA后Caski細胞中S100A9蛋白的表達 Western blot結果顯示，與陰性對照組相比，轉染S100A9 siRNA后Caski細胞中S100A9蛋白的表達明顯降低，見圖3。

圖3 轉染S100A9 siRNA后Caski細胞中S100A9蛋白表達的電泳圖

2.4 轉染S100A9 siRNA后Caski細胞侵襲和遷移能力的變化

2.4.1 Caski細胞侵襲能力的變化 Transwell檢測結果顯示，siRNA組的穿膜細胞數為（40.20±3.27）個，明顯低于陰性對照組的（55.80±4.81）個（P＜0.05），見圖4。

圖4 轉染S100A9 siRNA后Caski細胞侵襲能力的變化（a：陰性對照組；b：siRNA組；×400）

2.4.2 Caski細胞遷移能力的變化 Transwell檢測結果顯示，siRNA組穿過Transwell小室的細胞數為（35.60± 6.80）個，明顯低于陰性對照組的（45.60±3.57）個（P＜0.05）。

3 討論

S100A9是一類只存在于脊椎動物中的小分子酸性蛋白[7]。人S100A9位于染色體lq21，此區域穩定性差，容易發生缺失、異位和重疊等，并參與多種惡性腫瘤的發生、發展[8-9]。有文獻報道S100A9可抑制胃癌細胞的侵襲與轉移[10]，但多數研究發現S100A9可促進多種惡性腫瘤的侵襲與轉移。Kwon等[11]發現S100A9可通過激活p38 MAPK/NF-κB信號通路，進而促進細胞的侵襲與遷移能力；在前列腺癌[12]、肝細胞癌[13]中，外源性增加S100A9的表達，可激活p38 MAPK/NF-κB信號通路，從而促進細胞的遷移。在宮頸癌中，Zhao等[14]采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜發現有26個蛋白在正常宮頸組織、CIN和宮頸鱗癌中逐漸升高，其中包括S100A9蛋白。本課題組前期研究亦發現，在正常宮頸組織、CIN、宮頸癌中S100A9的表達逐漸升高[6]。但是，目前關于S100A9對宮頸鱗癌細胞生物學行為的影響尚未明確。

本研究發現轉染S100A9重組腺病毒能明顯提高C-33A細胞中 S100A9蛋白的表達，轉染 S100A9 siRNA能抑制Caski細胞中S100A9蛋白的表達。本實驗通過上述方法改變宮頸鱗癌細胞中S100A9的表達，并觀察其對細胞侵襲和轉移能力的改變。宮頸鱗癌C-33A細胞轉染S100A9重組腺病毒，可促進細胞侵襲與轉移的能力；宮頸鱗癌Caski細胞轉染S100A9 siRNA，可抑制細胞侵襲與轉移的能力。以上結果提示S100A9與宮頸鱗癌細胞的侵襲、轉移相關，但具體機制和通路有待進一步研究。

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Relationship between S100A9 expression and invasive/metastatic ability of squamous cervical cancer cells

ObjectiveTo investigate the relationship between S100A9 expression and invasive/metastatic ability of squamous cervical cancer cells.MethodsHuman squamous cervical cancer C-33A cells were transfected with S100A9 adenoviral vectors and Caski cells were transfected with S100A9 siRNA.The expression of S100A9 protein was measured by Western blot and the ability of cell invasion and migration was evaluated by Transwell cell assays.ResultsCompared with control groups,S100A9 protein was significantly increased in C-33A cells after transfected with S100A9 adenoviral vectors.The invasion and migration assay showed that the number of cells migrating through the Transwell membrane and chamber were significantly increased after C-33A cells were transfected with S100A9 adenoviral vectors (P＜0.05).Compared with control group,the expression of S100A9 was significantly decreased in Caski cells transfected with S100A9 siRNA.In Transwell cell assays,the number of cells migrating through the Transwell membrane and chamber were significantly lower in 100A9 siRNA-transfected Caski cells compared with control group(P＜0.05).ConclusionS100A9 may play its role in the invasion and migration of squamous cervical cancer cells.Upregulation of S100A9 promoted invasion and migration of squamous cervical cancer cells,and downregulation of S100A9 reduced invasion and migration of squamous cervical cancer cells.

S100A9 Squamous cervical cancerInvasion Migration

2016-10-05）

（本文編輯：陳丹）

國家自然科學基金資助項目（81372381）；浙江省醫藥衛生平臺重點資助計劃（2013ZDA016）

325027 溫州醫科大學附屬第二醫院婦產科

朱雪瓊，E-mail：zjwzzxq@163.com