草莓采后灰霉病生防菌Burkholderia contaminans培養基優化分析

施俊鳳，孫常青，李靜,3

（1山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所，太原030031；2山西省農業科學院作物科學研究所，太原030031；3山西大學生命科學學院，太原030031）

草莓采后灰霉病生防菌Burkholderia contaminans培養基優化分析

施俊鳳1，孫常青2，李靜1,3

（1山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所，太原030031；2山西省農業科學院作物科學研究所，太原030031；3山西大學生命科學學院，太原030031）

旨在研究洋蔥伯克霍爾德菌Burkholderia contaminans在搖瓶條件下的生物量最大培養基配方。試驗采用多因素二次通用旋轉組合設計的方法，通過對不同碳源、氮源和無機鹽種類和濃度對B. contaminans生長的影響，確定拮抗菌濃度最大的培養基配方。篩選出的最佳培養基配方為：麥芽浸粉2.11%、酵母提取物1.90%、磷酸二氫鉀0.05%，硫酸錳0.05%。在該培養條件下，伯克氏菌Burkholderia contaminans B-1生物量達到最大值，且經過進一步驗證，其優化效果較好。拮抗菌株B.contaminans培養條件的優化分析為該菌高產發酵工藝的建立奠定了基礎，促進了該菌株在果蔬采后生物防治的應用與產業化開發。

Burkholderia contaminans B-1；培養基；二次通用旋轉組合；優化分析

0 引言

草莓(Fragaria ananassa Duch.)屬薔薇科草莓屬，果實顏色鮮艷，果肉酸甜適口，由于其組織嬌嫩，外部缺乏保護皮層，在采后貯運中極易受損傷和病菌侵染，常溫下1～3天即會腐爛變質，嚴重限制了其生產的產業化和規模化[1]。灰霉病是草莓采后常見病害，其病原菌灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)寄主范圍廣，耐低溫，所以在果實貯藏環境中極易發生，直接影響其商品價值及食用價值[2-3]。用微生物進行采后病害的生物防治是近年來發展起來的一個新的研究領域。自從20世紀50年代Gutter等[4]首次報道枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)對水果病原菌具有生防作用以來，國內外學者對其采后病害的生物防進行了廣泛研究[5-6]。因此，生防菌劑的研發對于延長草莓貨架期以及草莓的生產具有重要意義。

Burkholder在1950年首次報道一株細菌可以引起洋蔥鱗莖發生腐爛，稱為洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)[7]。近年來，隨著細菌分類技術的發展，洋蔥伯克霍爾德菌已不僅僅作為一個種，而是一組基因型不同、表型相近的復合物，稱為洋蔥霍爾德菌復合群（Burkholderia cepacia complex，簡稱Bcc）[8]，目前洋蔥伯克霍爾德菌復合群共包括17個其因型[9]。有文獻報道，農業領域中洋蔥伯克霍爾德菌具有生物防治、生物降解以及促進植物生長等多種功能，有廣泛的應用前景。目前已有一些Bcc用于果實采后領域的相關報道，如Parke[10]發現Bcc不僅可以有效抑制梨青霉病、蘋果灰霉病和桃褐腐病等采后病害，對其植株的莖葉病害的也有較強的抑制作作。范青等[11]發現Bcc對甜櫻桃褐腐病表現出顯著的抑制效果，謝關林等[12]發現在離體條件下Bcc菌株可顯著抑制水稻紋枯病菌和惡苗病菌的生長。通過實驗證明，生防菌的拮抗效力與其生物量濃度密切相關，濃度越大，生防效果越好。因此，研究不同碳源、氮源和無機鹽對伯克氏菌Burkholderia contaminans B-1的發酵生物量的影響，并優化其配方，對于提高生防菌的拮抗效力和商業化應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

生防菌：B.contaminans B-1分離自杏果實表面，經純化后進行分子和生理生化鑒定，保存于-80℃。供試病原菌：于草莓果實自然發病部位分離灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)，純化后PDA平板培養7天，刮取分生孢子，采用血球計數法配制成濃度為1.0×l05個/mL的霉菌孢子懸浮液。

草莓品種為‘紅顏’，采自山西省太谷縣東陽鎮，達商品成熟度采收。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同濃度拮抗菌對草莓果實的抑制效果參照Bi等[13]的方法，挑選大小、成熟度一致、無機械傷的草莓果實，1.0%的次氯酸鈉溶液中浸泡1 min，無菌風吹干，用無菌鐵釘在其赤道部位刺直徑3 mm深度約3 mm的傷口，在傷口處分別加30 μL B.contaminans B-1發酵原液、5倍發酵液、10倍發酵液和無菌水，以加無菌水處理作為對照，無菌風吹干2 h后各傷口處再加15 μL霉菌孢子懸浮液，將各處理果實于16℃培養箱中保濕培養5天后，檢查其發病情況。

1.2.2 最佳碳源篩選、氮源和無機鹽的篩選將生防菌株在LB固體培養基活化后，于LB液體培養基中接種一環B.contaminans B-1，于50/250mL三角瓶以28℃200 r/min搖瓶培養24 h制備種子液。以1%YNB為基礎氮源，分別添加1%的不同碳源，28℃200 r/min進行篩選；以1%篩選出的最佳碳源為碳源，分別添加1%不同氮源進行氮源的篩選；再分別以1%最佳碳源和最佳氮源為基礎培養基，添加0.05%的8種無機鹽進行最佳無機鹽的篩選。每處理重復3次。

1.2.3 最佳培養基成分優化分析采用二次通用旋轉組合設計，試驗因子有碳源、氮源、無機鹽1和無機鹽2，每因子5個水平[14]。以B.contaminans B-1生長稀釋10倍液的OD600值作為響應值。試驗因子水平與編碼見表1。每處理3次重復。

表1 試驗因素水平與編碼表

1.2.4 統計分析試驗數據采用Desjgn-Expert 8.0.6統計軟件進行統計分析，進行31組處理組合，每處理組合設3次重復。

2 結果與分析

2.1 B.contaminans B-1對草莓傷口接種抑制效果

采用不同處理液處理草莓果實見圖1，對照果草莓高度腐爛，病害嚴重，基本整果腐敗潰爛。而發酵原液和稀釋5倍的發酵液接種草莓后，草莓果無腐爛現象，稀釋10倍的發酵液處理可使草莓果實腐爛率下降14.63%，果實的病斑直徑降低了63.63%（表2）。由此可見，生防菌株可有效抑制草莓采后灰霉病的發生，而且其抑制活性與其濃度呈正相關，濃度越大，抑制效果越好。

圖1 B.contaminansB-1對草莓傷口接種灰霉病抑制效果(16℃5d)

表2 生防菌不同處理液對草莓果實灰霉病抑制作用(P＜0.05)

2.2 生防菌對碳源和氮源的利用能力

B.contaminans B-1對不同碳源和氮源的利用能力見表3。由表3可知，在供試的11種碳源中，B.contaminans對麥芽浸粉利用能力最強，顯著高于其他碳源，在氮源中對酵母提取物的利用能力最強，顯著高于其他氮源。

2.3 拮抗菌對無機鹽的利用能力

B.contaminans B-1對無機鹽的利用如表4所示。從表中可知，在7種無機鹽中，除了K2HPO4、MnSO4、KH2PO4外，其余4種無機鹽對B.contaminans的生長均為負效應，其中K2HPO4和MnSO4正效應最強。因此，選取麥芽浸粉、酵母提取物、K2HPO4和MnSO4作為進行響應面設計的4個因素進行配方篩選。

2.4 回歸模型的建立

表3 伯克氏菌B.contaminans B-1對各種碳源和氮源的利用能力

以決策變量麥芽浸粉為X1，酵母提取物為X2，磷酸二氫鉀為X3，硫酸錳為X4，B.contaminans活菌數為目標函數Y，所得3次重復93組試驗數據如表5。通過數據建立拮抗菌與培養條件的回歸模型，回歸方程為：Y=1.35+0.099 X1+0.12 X2-0.013 X3-0.002486 X4-0.12X1X2+0.013 X1X3+0.004729 X1X4+0.022 X2X3-0.002687X2X4+0.019X3X4-0.14 X12-0.1 X22-0.075X32-0.098 X42。

表4 B.contaminans B-1對7種無機鹽的利用能力

表5 二次通用旋轉設計方案及結果

決定系數R2=0.9786，回歸方程極顯著(P＜0.01)，對各項回歸系數檢驗后（表6）可知：麥芽浸粉X1、酵母提取物X2及兩者二次項對B.contaminans的生長均有極顯著的影響(P＜0.01)，磷酸二氫鉀X3、硫酸錳X4的二次項和麥芽浸粉與酵母提取物交互作用也具有極顯著影響(P＜0.01)，而2種無機鹽和其交互作用影響不顯著(P＞0.05)，由各因素F值可看出，對B.contaminans生長影響作用依次為酵母提取物、麥芽浸粉、磷酸二氫鉀、硫酸錳。

2.5 單因子效應分析

由表7可知麥芽浸粉、酵母提取物對B. contaminans B-1生長均有極顯著影響(P＜0.01)，2種無機鹽則影響不顯著。將4因素中的3個固定在零水平降維分析，可得出以一個因素為變量的偏回歸模型，根據模型作單因素圖（圖2）。由圖2可知contaminansB-1的生長隨著麥芽浸粉、酵母提取物、磷酸二氫鉀、硫酸錳濃度的增加表現出先增后減的趨勢，表明這4個因素均具有最佳值，濃度過低或過高都影響菌株的生長。

續表5

表6 回歸方程各項回歸系數顯著性檢驗

2.6 培養條件分析

在回歸模型中，將一個因素定在零水平，等高線圖、曲面圖則可體現兩個因素的交互作用（圖3）。圖中，當麥芽浸粉固定在零水平時，B.contaminans B-1生長隨酵母提取物濃度的升高，呈現先上升后下降的趨勢；當酵母提取物固定在零水平時，拮抗菌的生長隨麥芽浸粉含量的升高呈現先逐步上升而后慢慢下降的變化，曲面的最高點出現在X1∈[0.5%，4%]，X2∈[0.75%，3%]區域。

2.7 培養條件的驗證

利用Desjgn-Expert 8.0.6統計軟件確定出各因素最佳水平為X1=0.115，X2=0.538，X3=-0.002，X4=-0.018，轉化成編碼前水平為：麥芽浸粉2.11%、酵母提取物1.9%、磷酸二氫鉀0.05%，硫酸錳0.05%，對應Y值為1.38901。為驗證此培養條件，用2.11%麥芽浸粉、1.9%酵母提取物、0.05%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸錳搖瓶培養B.contaminans B-1，得到的菌液稀釋后OD600為1.31。誤差為5.0%，與模型值接近，說明模型可用。

圖2 各單因子與contaminans B-1生物量的關系

圖3 麥芽浸粉與酵母提取物之間相互作用的等高線圖和曲面圖

3 討論與結論

實驗設計的優化方法應該能夠正確構建考核指標與其各影響因子的關系，即建立合適的數學模擬方程[15-16]。使用響應面設計法克服了正交設計只能處理離散的水平值而無法找出整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值的缺陷，還可以分析幾種因素間的交互作用，以達到較全面反映各因子水平的效果[17-20]。該方法可使實驗次數大大減少，因此廣泛應用于生產試驗和科學研究[21-22]。

近年來微生物菌劑的研發應用受到廣大研究者的普遍重視，其微生物制劑種類也較多，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)等。但是在生產應用中，常常存在發酵液活菌數量不高的問題，這樣不僅限制了應用效果，也限制了產品推廣[23]。關于洋蔥伯克霍爾德菌的不同基因型近年也有一些研究，如吳義飛等[24]發現洋蔥伯克霍爾德菌NSM-05的最適培養基為玉米粉、蛋白胨、氯化鈉和硫酸鎂，與本研究中篩選的碳源、氮源和無機鹽不盡相同，其原因可能是由于2個菌株基因型不同，所以對其不同營養條件的需求有差異。本試驗通過對拮抗菌株B.contaminans B-1培養基的優化篩選，其抑菌活性和活菌數量得到明顯提高，對草莓采后灰霉病有很好的防治效果。由于本實驗是在實驗室搖瓶條件下進行，要實現工業化生產，還需進行發酵罐條件放大實驗，在優化的發酵條件下隨時檢測pH變化、溶氧量變化、還原糖和氨基酸變化，在適當時滿足生防菌的營養需求，以提高生防菌發酵菌量和抑菌物質產量[25-26]。

綜上，本試驗首先考察了不同碳源、氮源和無機鹽等因素對伯克氏菌B.contaminans B-1生長的影響，根據篩選出的4個主要因素進一步進行二次通用旋轉組合法，確定其最佳培養基配方為：麥芽浸粉2.11%、酵母提取物1.9%、磷酸二氫鉀0.05%和硫酸錳0.05%，并對其可行性做了進一步驗證，為B.contaminans B-1的產業化應用了提供理論依據。

[1]呂建華,周慶新,周沙沙,等.丁香提取液對草莓保鮮效果的影響[J].食品與生物技術學報,2009,05:633-636.

[2]李艷萍,鄭服叢.草莓果實采后病害及保鮮技術[J].熱帶農業科學, 2002,22(2):64-69.

[3]孔秋蓮,修德仁,胡文玉,等.葡萄貯藏中SO2傷害與膜脂過氧化的關系[J].果樹學報,2008,25(3):322-326.

[4]Gutter Y,Littauer F.Antagonistic action of Bacillus subtilis against citrus fruit pathogens[J].Bulletin of the Research Council of lsrael, 1953,33(3):192-197.

[5]張紅印,馬龍傳,姜松,等.臭氧結合拮抗酵母對草葛采后灰霉病的控制[J].農業工程學報,2009,25(5):258-263.

[6]張麗霞,黃開紅,周劍忠,等.枯草芽抱桿菌FR4對采后草驀的保鮮效果[J].江西農業學報,2009,21(9):124-127.

[7]Coenve T,Vandamme P,Govanjr W,et al.Taxonomy and identification of the Burkholderia cepacia complex[J].Journal of Clinical Microbiology,2001,39:3427-3436.

[8]Coenye T,Vandamme P.Diversity and significance of Burkholderia speciesoccupyingdiverseecologicalniches.Environmental Microbiology,2003,5:719-729.

[9]Elke Vanlaere,Adam Baldwin,Dirk Gevers,et al.Taxon K,a complex within the Burkholderia cepacia complex,comprises at least two novel species,Burkholderia contaminans sp.nov.and Burkholderia lata sp.nov.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2009,59:102-111.

[10]Parke J L,Gurian-scherma D.Diversity of the Burkholderia cepacia complex and implications for risk assessment of biological control strains[J].Annual Review of Phytopathology,2001,39:225-258.

[11]范青,田世平,姜愛麗,等.采摘后果實病害生物防治拮抗菌的篩選和分離[J].中國環境科學,2001,21:313-316.

[12]謝關林,金揚秀,徐傳雨,等.我國水稻紋枯病拮抗細菌種類研究[J].中國生物防治,2003,19(4):166-170.

[13]Bi Y,Tian S P,Zhao J,et al.Harpin induces local and systemic resistance against Trichothecium roseum in harvested Hami melons [J].Postharvest Biology Technology,2005,38:183-187.

[14]榮廷昭.田間試驗與統計分析[M].北京:農業科學技術出版社, 1998:299-301.

[15]吳春海,郝玉有,王永紅,等.統計學法優化必特螺旋霉素發酵培養基[J].中國抗生素雜志,2008,33(7):446-448.

[16]Srinivasulu B,Kim Y J,Chang Y K,et al.Construction of asm2 deletionmutantofActinosynnemapretiosumandmedium optimization for ansamitocin P-3 production using statistical approach[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2006,16 (9):1338-1346.

[17]海洪,汪坤,金文英,等.Box-Bchnkcn響應面法優化超聲波提取蠶沙中葉綠素的工藝研究[J].食品工業科技,2009,30(3):207-211.

[18]王新雯,海洪,金文英,等.微波-超聲波聯合提取銀杏葉黃酮工藝的響應面法分析[J].食品科技,2010,35(3):189-193.

[19]何慶元,吳萍,張曉紅,等.不同秋眠性首蓓SRAP體系優化及遺傳多樣性分析[J].草業學報,2011,20(2):203-211.

[20]施俊鳳,孫常青,王春生,等.響應面法優化采后生防菌梅奇酵母培養條件[J].中國食品學報,2015,15(1):80-84.

[21]王云飛,王成國.響應面法的理論及應用[J].中央民族大學學報:自然科學版,2005,14(3):236-240.

[22]花玉鵬,文才藝,劉偉成,等.響應曲面法優化利迪鏈霉菌A02發酵培養基[J].中國生物防治學報,2011,27(4):520-527.

[23]郭本恒.益生菌[M].北京:化學工業出版社,2004:27-29.

[24]吳義飛,吳小芹.新洋蔥伯克霍爾德菌NSM-OS產抗菌物質的培養條件[J].林業科技開發,2014,28(4):83-86.

[25]李全陽,夏文水.乳酸菌胞外多糖的研究[J].食品與發酵工業,2003, 29(5):86-90.

[26]孫笑非,孫鳴.一株枯草芽孢桿菌發酵培養基的優化[J].飼料研究, 2009,1(2):68-69.

Medium Optimization Analysis of Biocontrol Bacteria Burkholderia contaminans B-1 Against Fruit Postharvest Grey Mould

Shi Junfeng1,Sun Changqing2,Li Jing1,3

(1Institute of Agricultural Product Storage and Fresh Keeping,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030031,Shanxi, China;2Institute of Crop Sciences,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan,030031,Shanxi,China;
3College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,Shanxi,China)

This objective was to discover the culture medium formulation of Burkholderia contaminans with the biggest biomass yield under shake flask conditions.In this experiment,we used the multi-factor quadratic general rotary unitized design method to study the effects of varied carbon sources,nitrogen sources and inorganic salt types&concentrations on strain growth,and finally determined the proper formulation.The optimal medium formulation was as follows:malt powder 2.11%,yeast extract 1.90%,KH2PO40.05%and MnSO40.05%.It had been proved that the biomass of B.contaminans reached the maximum under this condition and showed better optimization effects by further detection.This optimization analysis will pave the way for establishing high yield fermentation process of B.contaminans,and facilitate its application in afterharvest biocontrol of fruits and vegetables,and industrialized development as well.

Burkholderia contaminans B-1;Culture Medium;Quadratic General Rotary Combination; Optimization Analysis

S476

A論文編號：cjas16060005

山西省科技攻關項目“拮抗菌Burkholderia contaminans對草莓采后生防技術的研究”(20140311025-2)；山西省農業科學院博士基金“拮抗菌Burkholderia contaminans對草莓采后生防潛力研究”(YBSJJ1414)；山西省農業科學院博士后基金“生防菌株對果實采后灰霉病防治機理研究”(BSH-2015JJ-003)。

施俊鳳，女，1977年出生，山西代縣人，副研究員，博士，主要從事果蔬采后病害及其生物防治研究。通信地址：030031山西省太原市小店區龍城大街79號省農科院保鮮所，Tel：0351-7126730，E-mail：sjfty@126.com。

2016-06-01，

2016-07-21。