鼻腔鼻竇鱗狀細胞癌細胞中PRL-3表達的臨床意義*

陸鴻略，馬桂琴，岳卓立△，康 菲

(承德醫學院附屬醫院：1.耳鼻咽喉科；2.體檢科，河北承德 067000)

鼻腔鼻竇鱗狀細胞癌細胞中PRL-3表達的臨床意義*

陸鴻略1，馬桂琴1，岳卓立1△，康 菲2

(承德醫學院附屬醫院：1.耳鼻咽喉科；2.體檢科，河北承德 067000)

目的 探討促肝細胞再生磷酸酶-3(PRL-3)在鼻腔鼻竇鱗狀細胞癌(SNSCC)中表達的臨床意義。方法 采用免疫組織化學及逆轉錄PCR(RT-PCR)方法檢測62例SNSCC組織(SNSCC組)中PRL-3蛋白的表達水平，并對30例鼻息肉患者(NP組)，以及25例正常鼻腔黏膜(對照組)做相同蛋白表達并進行對比。結果 在蛋白水平和基因水平檢測，均發現SNSCC組中PRL-3的表達高于NP組及對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。PRL-3的表達情況在不同的性別、年齡中差異無統計學意義(P>0.05)，而隨著TNM分期的增高，分化程度的降低及合并淋巴結轉移，PRL-3的表達明顯增高(P<0.05)。結論PRL-3的表達可以對SNSCC的增殖活性作很好的參照，表達強度可明顯反映SNSCC細胞增殖活性，PRL-3可能是SNSCC的一個獨立預后指標，提示預后不良。

鼻腔；鼻竇；癌，鱗狀細胞；促肝細胞再生磷酸酶-3

促肝細胞再生磷酸酶-3(PRL-3)屬于酪氨酸蛋白磷酸酶，它是目前發現的與惡性腫瘤細胞的轉移相關的一個重要基因，它可以促進惡性腫瘤細胞的增殖黏附及遷移[1]。目前，鮮見PRL-3在鼻腔鼻竇鱗狀細胞癌(SNSCC)中的表達及意義的報道，其與SNSCC的生長、浸潤和轉移關系尚待研究。本研究就采用免疫組織化學及逆轉錄PCR(RT-PCR)的方法檢測PRL-3在SNSCC中的表達情況，分析PRL-3與SNSCC臨床病理特征的關系，探討PRL-3與SNSCC分化、轉移及預后之間的關系，為臨床早期診斷SNSCC提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2007年12月至2014年12月手術切除或活檢的62例SNSCC組織(SNSCC組)，30例鼻息肉(NP組)和25例接受中鼻甲部分切除術患者的切除中鼻甲黏膜組織(對照組)。其中，SNSCC組男39例，女23例，年齡32～77歲；NP組男19例，女11例，年齡16～70歲；對照組男13例，女12例，年齡18～53歲。SNSCC組均未接受任何的放化療或免疫治療。所有標本取材后平分為兩份，一份送病理科做成石蠟塊，另一份放入液氮中冰凍保存。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人PRL-3單克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司；羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)/辣根酶標記二抗和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Trizol、逆轉錄試劑盒購自Takara公司；PCR引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司；50 bp DNA Ladder購自北京天根生化有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(SP法)檢測PRL-3的表達 取包埋石蠟塊、4 μm連續切片。按SP法試劑盒操作規程說明書進行免疫組織化學染色，切片常規脫蠟、水化，進行抗原修復，經DAB顯色，蘇木素復染后，脫水、封片。用已知陽性標本陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照。結果判定：PRL-3陽性表達為在細胞膜及膜周細胞質中出現棕黃色顆粒，每張切片取5～8個高倍視野進行觀察，每個視野的細胞計數為100個，取平均數，根據陽性細胞百分比來對PRL-3陽性細胞數進行判斷，≤25%為(-)，>25%～<51%為(+)，51%～75%為(++)，>75%為(+++)。

1.2.3 RT-PCR法檢測PRL-3的表達 凍存的SNSCC標本按Trizol一步法，提取總RNA，將2 μg 總RNA為模板逆轉錄為cDNA，以cDNA產物為模板，PRL-3和GAPDH為引物，行PCR擴增。根據已知PRL-3基因序列，上游引物序列：5′-GGG ACT TCT CAG GTC GTG TC-3′,下游引物序列5′-AGC CCC GTA CTT CTT CAG GT-3′。β-actin上游引物序列5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3′,下游引物序列5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′。嚴格按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作，熒光定量PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環。72 ℃終延伸10 min，取PCR產物行質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳分析，經溴化乙錠顯影后，凝膠成像系統成像，并進行光密度半定量分析。目的基因的相對表達量以目的條帶積分光密度(OD)值與內參照條帶OD值的比值表示。

2 結 果

2.1PRL-3蛋白在3組患者標本組織中的表達情況PRL-3蛋白在SNSCC組(75.81%)中的表達顯著高于在對照組(20.00%)及NP組(40.00%)中的表達，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 PRL-3蛋白在3組組織中的表達情況[n(%)]

a：P<0.05，與SNSCC組比較。

A：對照組；B：NP組；C：SNSCC組。

圖1PRL-3蛋白在3組組織標本中的表達情況(SP，×200)

2.2PRL-3蛋白在SNSCC組織中的表達與臨床病理特征的關系PRL-3蛋白在SNSCC中的表達與病理分期、分化程度及合并淋巴結轉移有關(P<0.05)，與性別、年齡無關(P>0.05)，見表2。

表2 PRL-3蛋白在SNSCC組織中的表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

續表2 PRL-3蛋白在SNSCC組織中的表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3RT-PCR法檢測PRL-3蛋白在3組組織中的表達SNSCC組中的PRL-3mRNA相對表達量(0.89±0.09)明顯高于NP組(0.57±0.06)及對照組(0.21±0.02)(P<0.05)。RT-PCR反應后電泳結果見圖2。

M：100bpDNAMarker；1.對照組；2.NP組；3.SNSCC組。

圖2RT-PCR檢測PRL-3蛋白在3組組織中的表達

3 討 論

PRLs屬于一類酪氨酸蛋白磷酸酶，其家族包含3個亞型，即PRL-1、PRL-2和PRL-3。而其中以PRL-3在腫瘤中的生物活性最顯著。PRL-3位于染色體8q24.3上，含有PTP催化位點序列，其編碼蛋白產物含有一個保守的C-末端半胱氨酸CAAX殘基-異戊烯化結構域[2]，此結構域內的Cys104和Arg110保守催化殘基與PRL-3的酶活性有關。PRL-3蛋白在人的骨骼肌、胰腺組織及心肌細胞中有不同程度的表達，而腦肺肝腎等組織鮮有表達[3]。它具有促進細胞生長和增殖，增強惡性細胞遷移和浸潤能力，還有促進細胞惡化及轉移等多種功能[4-7]，具體作用機制包括以下幾點：(1)PRL-3可通過激活Rho信號轉導途徑，調控腫瘤細胞的侵襲和活動性，促進腫瘤細胞的增殖及轉移[8-9]；(2)PRL-3可通過介導ERK信號傳導通路，促進腫瘤血管的生成，從而促進腫瘤的生長及成熟，促進淋巴結轉移及遠處轉移[10-11]；(3)PRL-3可通過誘導促進血管內皮生長因子(VEGF)及其受體的過度表達，促進腫瘤的生長、侵襲及轉移[6,12]；(4)PRL-3還可通過調節其他癌癥相關基因的表達來介導腫瘤的侵襲、轉移[13]；(5)PRL-3通過正調控PI3K細胞通路，抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞分裂增殖，誘導腫瘤細胞生長。此外，PRL-3還可通過調節PI3K通路促進腫瘤的侵襲及轉移[14]；(6)PRL-3可促進轉移性腫瘤的形成[15]。本研究顯示，SNSCC組織中的PRL-3的表達明顯高于NP組織及正常鼻腔黏膜組織，而且與SNSCC的TNM分期、分化程度及淋巴結轉移密切相關。此結果提示在SNSCC的發生、發展及轉移過程中PRL-3可能發揮了重要的作用。因此，檢測PRL-3可能對早期發現SNSCC具有重要的臨床意義，同時，對SNSCC生物學行為、預后具有重要意義，有可能成為SNSCC治療的靶點及預后標記物。

本研究對PRL-3高表達與SNSCC的發生、發展及轉移的關系在分子水平上提供了一些理論基礎，但其具體作用機制，尤其是PRL-3通過何途徑促進SNSCC轉移的，仍需進一步探討。

[1]孫振華，卜平．胃癌PRL-3與Bmi-1mRNA聯合表達的定量分析及其意義[J]．廣東醫學，2012，33(7)：987-989．

[2]郭延林，朱彥君，伍青.PRL的生物學功能及與腫瘤關系的研究進展[J].現代腫瘤醫學,2013,21(3):659-662.

[3]LeungWH,QueenieP,LinWW,etal.PRL-3mediatestheproteinmaturationofULBP2byregulatingthetyrosinephosphorylationofHSP60[J].JImmunol,2015,194(6):2930-2941.

[4]OokiA,YamashitaK,KikuchiS,etal.TherapeuticpotentialofPRL-3targetingandclinicalsignificanceofPRL-3genomicamplificationingastriccancer[J].BMCCancer,2011(11):122.

[5]XuYJ,ZhuMC,ZhangSH,etal.ExpressionandprognosticvalueofPRL-3inhumanintrahepaticcholangiocarcinoma[J].PatholOncolRes,2010,16(2):169-175.

[6]楊美蘭，鄧亞平，劉志紅．PRL-3和VEGF在結腸癌中表達的臨床病理研究[J]．現代生物醫學進展，2012，12(3)：485-488．

[7]GuoK,TangJP,JieL,etal.EngineeringthefirstchimericantibodyintargetingintracellularPRL-3oncoproteinforcancertherapyinmice[J].Oncotarget,2012,3(2):158-171.

[8]MayinuerA,YasenM,MogushiKA,etal.UpregulationofproteintyrosinephosphatasetypeIVAmember3(PTP4A3/PRL-3)isassociatedwithtumordifferentiationandapoorprognosisinhumanhepatocellularcarcinoma[J].AnnSurgOncol,2013,20(1):305-317.

[9]FiordalisiJJ,DewarBJ,GravesLM,etal.Src-Mediatedphosphorylationofthetyrosineph-osphatasePRL-3isrequiredforprl-3promotionofRhoactivation,motilityandinvasion[J].PLoSOne,2013,8(5):1-10.

[10]BiliciA,UstaaliogluBB,YavuzerDA,etal.Prognosticsignificanceofhighphosphataseofregeneratingliver-3expressioninpatientswithgastriccancerwhounderwentcurativegastrectomy[J].DigDisSci,2012,57(6):1568-1575.

[11]PengL,XingX,LiW,etal.PRL-3promotesthemotility,invasion,andmetastasisofLoVocoloncancercellasthroughPRL-3-integrinbetal-ERK1/2and-MMP2signaling[J].MolCancer,2009(8):110.

[12]FiordalisiJJ,KellerPJ,CoxAD.PRLtyrosinephosphatasesregulateRhofamilyGTPasestopromoteinvasionandmotility[J].CancerRes,2006,66(6):3153-3161.

[13]FangXY,SongR,ChenW,etal.PRL-3promotesthemalignantprogressionofmelanomaviatriggeringdephosphorylationandcytoplasmiclocalizationofNHERF1[J].JInvestDermatol,2015,135(9):2273-2282.

[14] 張建龍，張縈斐，張育超，等.PRL-3調節P13K信號通路在促進結腸癌細胞增殖侵襲中的作用[J]．中山大學學報(醫學科學版)，2013,34(1)：16-21.

[15]AnnaP,KatarzynaGU,KatarzynaN,etal.PRL-3andE-cadherinshowmutualinteractionsandparticipateinlymphnodemetastasisformationingastriccancer[J].TumourBiology,2014,35(7):6587-6592.

Clinical significance of PRL-3 expression in sinonasal squamous cell cancer cells*

LuHonglue1，MaGuiqin1，YueZhuoli1△，KangFei2

(1.DepartmentofOtolaryngology；2.DepartmentofPhysicalExamination,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde，Hebei067000，China)

Objective To investigate the clinical significance of PRL-3 expression in sinonasal squamous cell cancer(SNSCC).Methods The immunohistochemical method and RT-PCR were adopted to detect the PRL-3 protein expression level in 62 cases of SNSCC tissue (SNSCC group),30 cases of nasal polyps(NP group) tissue and 25 cases of normal nasal mucosa tissue(control group).The obtained results were compared.Results Both in the protein level and gene level detection，the expression of PRL-3 in the SNSCC group was higher than that in the NP group and control group,the difference was statistically significant (P<0.05).The expression of PRL-3 had no significant differences among different ages and between different genders(P>0.05)，but with TNM stage increasing,differentiation degree decreasing and complicating lymph node metastasis,the expression of PRL-3 was significantly increased(P<0.05).Conclusion The PRL-3 expression can serve as good reference for the proliferation activity of SNSCC,its expressing intensity can obviously reflect the SNSCC cell proliferation activity,PRL-3 probably is an independent prognostic index of SNSCC，indicating poor prognosis.

nasal cavity;paranasal sinus;carcinoma，squamous cell;regenerative liver phosphatase-3

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.019

承德市科學技術研究與發展計劃項目(201601A047)。

陸鴻略(1978-)，主治醫師，碩士，主要從事鼻部疾病的診斷與治療方面研究。△

E-mail：yuezhuoli@163.com。

R

A

1671-8348(2017)01-0081-03

2016-07-20

2016-09-12)