姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠PI3K/AKT/mTOR的影響*

蘭 晶，潘敬芳

(宜昌市中心人民醫(yī)院/三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，宜昌湖北 443000)

姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠PI3K/AKT/mTOR的影響*

蘭 晶，潘敬芳

(宜昌市中心人民醫(yī)院/三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，宜昌湖北 443000)

目的 探討姜黃素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制。方法 通過(guò)線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型。評(píng)估姜黃素對(duì)大鼠腦梗死范圍、腦含水量、神經(jīng)癥狀、腦組織病理形態(tài)，以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)、B細(xì)胞淋巴因子2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、活化性半胱胺酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleavage-Caspase-3)的表達(dá)影響。結(jié)果 姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其可以減輕大鼠神經(jīng)癥狀和腦組織病理形態(tài)的改變，以及腦梗死面積和腦含水量。此外，姜黃素還可以減輕MDA、Bax、Cleavage-Caspase-3、促炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和TNF-α的表達(dá)，增加PI3K、p-AKT、mTOR、Bcl-2、Caspase-3、CAT、GPX與SOD表達(dá)。結(jié)論 姜黃素預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注有明顯保護(hù)作用，該作用可能與激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活而抑制炎癥,凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)。

姜黃素；腦缺血；再灌注損傷；炎癥；凋亡；氧化應(yīng)激；PI3K/AKT/mTOR

腦缺血再灌注損傷是腦血供中斷后，重新恢復(fù)大腦血供導(dǎo)致腦損傷反而加重的臨床危象,是人類致死和致殘的重要原因，僅次于心臟疾病和癌癥。因此，減輕腦缺血再灌注損傷具有重要的臨床現(xiàn)實(shí)意義。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具體機(jī)制尚不清楚[1-3]。目前研究顯示其發(fā)病機(jī)制可能為腦供血中斷，導(dǎo)致腦組織細(xì)胞缺血、缺氧，誘發(fā)炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化自由基的產(chǎn)生，而恢復(fù)血供后進(jìn)一步誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及氧自由基，因此抑制炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激是減輕腦缺血再灌注損傷的有效途徑[1-3]。姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物如姜黃、莪術(shù)、郁金的干燥根莖中提取的一種天然有效成分,最近研究發(fā)現(xiàn)其有抗氧化、抗凋亡和抗炎的活性[4-8]，而炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注損傷的重要致病機(jī)制[1-3]。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠構(gòu)建腦缺血再灌注損傷模型,探討姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷后的作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 姜黃素(Sigma公司，USA)經(jīng)HPLC鑒定純度超過(guò)99%,用含6%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇和6%(體積分?jǐn)?shù))聚乙二醇稀釋，水合氯醛(Google生物)。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks，CST公司,USA),磷酸化蛋白激酶B(p-AKT,CST公司,USA)，蛋白激酶B(AKT,CST公司,USA)，雷帕霉素靶蛋白(mTOR,CST公司,USA),B細(xì)胞淋巴因子2(Bcl-2,CST公司,USA),Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax,CST公司,USA),半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3,CST公司,USA)，活化性半胱胺酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleavage-Caspase-3，CST公司,USA)，三氨基甲烷(TRIzol)試劑(Invitrogen公司,USA),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia公司,USA)，雙鏈嵌合熒光染色SYBR green(Takara公司,Japan)，實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)引物(擎科生物技術(shù)有限公司，訂單號(hào)SY14032221)，蘇木素-伊紅染色(HE)試劑由三峽大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室配制。紫外分光光度計(jì)(Thermo fisher)、逆轉(zhuǎn)錄儀(eppendorf)、RT-PCR儀(BIO-RAD IQ5)、顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均為濰坊醫(yī)學(xué)院提供。SD大鼠購(gòu)自北京華?？祵?shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，質(zhì)量合格證號(hào)420131024，飼養(yǎng)于三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SYXK(20130145)，設(shè)施使用證明號(hào)00134727。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立與分組 50只健康雄性SD大鼠，2月齡，體質(zhì)量250～280克。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，狀態(tài)良好，分為假手術(shù)組(Sham組)，模型組(IRI組)和姜黃素組(Cur組),每組10只。Cur組術(shù)前30 min給予姜黃素25、50、100 mg/kg腹腔注射，劑量參考文獻(xiàn)[9]。Sham組和IRI組則給予等體積腹腔注射生理鹽水，Sham組只分離動(dòng)脈不插線；模型組和Cur組方法建立大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，具體方法參考文獻(xiàn)[9],手術(shù)過(guò)程順利,無(wú)死亡動(dòng)物,術(shù)后各組單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.2.2 神經(jīng)癥狀評(píng)分、腦梗死范圍及腦含水量測(cè)定 大鼠腦缺血再灌注24 h后，按文獻(xiàn)[9]制訂的5分制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。0分:正常，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分:向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分:向?qū)?cè)傾倒；4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。大鼠腦缺血再灌注損傷24 h后，快速斷頭取腦，-20 ℃速凍30 min，去除嗅球、小腦和低位腦干，腦組織從額極向后做連續(xù)冠狀切成5片，將腦片置入37 ℃ 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染料中溫浴 30 min。染色結(jié)果白色為梗死灶，紅色為正常腦組織。數(shù)碼相機(jī)拍照，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量腦梗死面積并計(jì)算腦梗死體積占大腦總體積的百分比。大鼠腦缺血再灌注損傷 24 h 后將大鼠斷頭，去掉嗅球、小腦和低位腦干，稱取大腦濕質(zhì)量，107 ℃烘烤72 h后稱取干質(zhì)量。腦含水量(%)= (濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.2.3 腦組織病理組織學(xué)檢查 腦組織置于4%多聚甲醛液4 ℃后固定1周。依次脫水、透明、浸蠟及包埋，行厚 8 μm 冠狀切片，常規(guī)HE染色、封片，光鏡下觀察，損傷評(píng)分參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 取腦組織于精微天平稱質(zhì)量，按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液(以1∶50加入50×cocktail)，檢測(cè)腦組織PI3K(1∶2 000),p-AKT(1∶1 000),AKT(1∶1 000),mTOR(1∶500)，Bax(1∶500)，BCL-2(1∶500),Caspase-3(1∶500),Cleavage-Caspase-3(1∶500)，β-actin(1∶3 000)表達(dá)，具體方法參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)腦組織中巨噬細(xì)胞炎癥因子1(MCP-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的mRNA表達(dá) 稱取適量腦組織，置入1.5 mL EP管中，利用 TRIzol 法提取總 RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA水平。采用 TaqMan Reverse Transcription Reagents 試劑盒， 將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用 Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR以β-actin為內(nèi)參,具體方法參考文獻(xiàn)[9]。取缺血側(cè)大腦皮層，所用特異性引物為擎科生物技術(shù)有限公司合成。TNF-α引物大小為75 bp，上游引物：5′-GCC TCG TCT CAT AGA CAA GAT GGT-3′；下游引物：5′-GAA GGC AGC CCT GGT AAC C-3′。MCP-1引物大小為143 bp，上游引物：5′-TCT CGC CCA GGG AGT GCA AAG AGA G-3′；下游引物：5′-TAT CGC CAA GGG AAC ATC TCG AAG CG-3′。IL-6引物大小為84 bp，上游引物：5′-CTG CAA GAG ACT TCC ATC CAG-3′；下游引物5′-AGT GGT ATA GAC AGG TCT GTT GG-3′。β-actin引物大小為610 bp，上游引物：5′-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3′；下游引物：5′-CAA TAG TGA TGA CCT GGC CGT-3′。擴(kuò)增條件為：95 ℃(10 min)→95 ℃(10 s)→60 ℃(1 min)×40個(gè)循環(huán)，利用圖像分析儀器上進(jìn)行掃描分析，將IL-6、MCP-1和TNF-α基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度之比作為IL-6、MCP-1和TNF-α基因表達(dá)值。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)血清中IL-6、MCP-1和TNF-α表達(dá)水平 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)血清中IL-6、MCP-1和TNF-α表達(dá)水平。

1.2.7 測(cè)定腦組織勻漿中指標(biāo)水平 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腦組織勻漿中腦組織中丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)大鼠神經(jīng)癥狀，腦梗面積和腦含水量的影響 與Sham組相比，IRI組神經(jīng)行為缺陷，腦梗死面積和腦含水量均明顯增加(P<0.05)，而Cur(低、中、高劑量)組與IRI組相比，神經(jīng)行為缺陷，腦梗死面積和腦含水量均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。姜黃素100mg/kg可得到最佳保護(hù)效果。

表1 姜黃素對(duì)腦梗死、腦水腫和神經(jīng)功能缺損的影響

a:P<0.05，與Sham組比較；b:P<0.05，與IRI組比較。

2.2 姜黃素對(duì)腦組織病理結(jié)構(gòu)的影響 與Sham組相比，IRI組神經(jīng)元細(xì)胞損傷，固縮核和神經(jīng)元染色均明顯增加(P<0.05)，其損傷評(píng)分分別為IRI組(4.0±0.5)分，而Sham組(0.5±0.5)分。與IRI組相比，Cur組神經(jīng)元細(xì)胞損傷，固縮核和神經(jīng)元染色均明顯降低(P<0.05)，其損傷評(píng)分為(1.5±0.5)分,見(jiàn)圖1。

*:P<0.05，與Sham組比較；#:P<0.05，與IRI組比較。

圖1 姜黃素預(yù)處理對(duì)腦組織病理結(jié)構(gòu)的影響(×400)

2.3 姜黃素對(duì)PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR蛋白表達(dá)的影響 與Sham組相比，IRI組PI3K,p-AKT和mTOR表達(dá)均明顯增高(P<0.05),但AKT表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與IRI組相比，Cur組PI3K,p-AKT和mTOR表達(dá)均進(jìn)一步增加(P<0.05)， 而AKT表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

2.4 姜黃素對(duì)腦組織促炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和TNF-αmRNA的表達(dá)影響 與Sham組相比，IRI組促炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和TNF-αmRNA表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05) ，而Cur組與IRI組相比,促炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和TNF-αmRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

圖2 WB檢測(cè)姜黃素預(yù)處理對(duì)PI3K、p-AKT、AKT和mTOR 蛋白表達(dá)的影響

組別PI3K/β-actinp-AKT/AKTmTOR/β-actinSham組0.12±0.030.16±0.030.07±0.02IRI組0.41±0.03a0.55±0.03a0.36±0.04aCur組0.78±0.04ab0.87±0.04ab0.54±0.04ab

a:P<0.05，與Sham組比較；b:P<0.05，與IRI組比較。

表3 姜黃素對(duì)IL-6 、MCP-1和TNF-α mRNA表達(dá)水平的影響

a:P<0.05，與Sham組比較；b:P<0.05，與IRI組比較。

2.5 姜黃素對(duì)血清中促炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和TNF-α的表達(dá)影響 與Sham組相比，IRI組促炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和TNF-α表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05)，而Cur組與IRI組相比,促炎癥細(xì)胞因子IL-6水平增高，MCP-1和TNF-α表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 姜黃素對(duì)血清中IL-6 、MCP-1和TNF-α表達(dá)影響

a:P<0.05，與Sham組比較；b:P<0.05，與IRI組比較。

2.6 姜黃素對(duì)CAT、GPx、SOD和MDA表達(dá)影響 與Sham組相比,IRI組CAT、GPx和SOD表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而MDA表達(dá)增高(P<0.05)；Cur組與IRI組相比，CAT、GPx和SOD的表達(dá)均明顯增高(P<0.05)，而MDA表達(dá)降低(P<0.05),見(jiàn)表5。

2.7 姜黃素對(duì)腦組織Caspase3、Cleavage-Caspase-3、Bax和BCL-2表達(dá)影響 與Sham組相比，IRI組Cleavage-Caspase-3和Bax表達(dá)明顯增高(P<0.05)，而Caspase-3和Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)。Cur組與IRI組相比，Cleavage-Caspase-3和Bax表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而Caspase-3和Bcl-2表達(dá)明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表6。

表5 姜黃素對(duì)CAT、GPx、SOD和MDA表達(dá)影響

a:P<0.05，與Sham組比較；b:P<0.05，與IRI組比較。

圖3 WB檢測(cè)姜黃素預(yù)處理對(duì)Cleavage-Caspase-3、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

組別Caspase-3/β-actinCleavage-Caspase-3/β-actinBax/β-actinBcl-2/β-actinSham組0.83±0.050.12±0.030.13±0.020.57±0.04IRI組0.45±0.03a0.55±0.04a0.68±0.05a0.25±0.02aCur組0.62±0.03b0.23±0.04b0.33±0.04b0.42±0.03b

a:P<0.05，與Sham組比較；b:P<0.05，與IRI組比較。

3 討 論

腦缺血再灌注損傷既往常好發(fā)于腦外，休克等過(guò)程中的危重癥，但隨著心臟體外大循環(huán)手術(shù)，心臟移植等多種心血管外科手術(shù)的廣泛開(kāi)展，其發(fā)病率越發(fā)增高,已成為誘發(fā)腦梗的重要原因，目前已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的身心健康[1-3]。目前尚無(wú)有效的干預(yù)手段，因而要尋找新的藥物減輕腦缺血再灌注損傷至關(guān)重要。既往研究提示腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制涉及炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激、壞死、自噬等[1-3]。本研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷可上調(diào)促炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和TNF-α表達(dá)，增加促凋亡蛋白Cleavage-Caspase-3Bax和促氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA表達(dá)，減少抗凋亡蛋白Caspase-3和Bcl-2表達(dá)，以及下調(diào)抗氧化應(yīng)激產(chǎn)物CAT,GPx和SOD表達(dá)，這與既往研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中扮演重要角色[1-3]，因此，抑制炎癥,凋亡和氧化應(yīng)激是減輕腦缺血再灌注損傷的有效途徑。

姜黃素是從姜科植物中提取的一種小相對(duì)分子質(zhì)量的多酚類物質(zhì),是姜黃的主要活性成分,大約占姜黃的2%～8%。既往大量研究表明,姜黃素具有清除自由基、抗氧化、抗真菌、抗炎、抗凋亡、抗癌，以及改善心血管系統(tǒng)等生物學(xué)活性[4-8]。對(duì)心臟、肝臟等器官缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，但對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制尚不清楚[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可減少促炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和TNF-α表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Cleavage-Caspase-3和Bax及促氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA的表達(dá)，而增加凋亡蛋白Caspase-3和Bcl-2，上調(diào)抗氧化應(yīng)激產(chǎn)物CAT,GPx和SOD的表達(dá)。這顯示姜黃素可通過(guò)抗炎、抗凋亡和抗氧化應(yīng)激途徑而減輕腦缺血再灌注損傷。但姜黃素在腦缺血再灌注損傷中抑制炎癥，凋亡和氧化應(yīng)激的具體機(jī)制不清。

mTOR是一種進(jìn)化上相對(duì)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是AKT下游的一個(gè)重要靶點(diǎn)，可通過(guò)磷酸化其下游的靶蛋白，參與基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)， 進(jìn)而影響炎癥、氧化應(yīng)激、自噬、凋亡等生物學(xué)活動(dòng)[13]。其激活途徑為細(xì)胞內(nèi)外因子通過(guò)受體酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K在PDK1的協(xié)同下磷酸化AKT?；罨腁KT磷酸化TSC2， 而磷酸化的TSC2可通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)使Rheb從TSC1/TSC2復(fù)合物中解聚，從而使Rheb活性增強(qiáng)，進(jìn)而激活mTOR[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷可增加PI3K、p-AKT和mTOR的表達(dá),而姜黃素可進(jìn)一步增加PI3K、p-AKT和mTOR的表達(dá)，這提示姜黃素可進(jìn)一步增加PI3K/AKT/mTOR信號(hào)途徑的活性，其調(diào)節(jié)為正向調(diào)節(jié)。

綜上所述，姜黃素可通過(guò)進(jìn)一步促進(jìn)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活而減輕炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激，進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷。但是姜黃素是直接作用于PI3K信號(hào)分子還是通過(guò)調(diào)節(jié)其上游激酶和(或)信號(hào)分子而間接發(fā)揮作用仍不清楚，除PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路外，是否還有其他信號(hào)通路涉及姜黃素抑制炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激，尚需進(jìn)一步更深入的研究。

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Effect of curcumin on PI3K/AKT /mTOR in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury*

LanJin,PanJingfang

(DepartmentofNeurology,YichangMunicipalCentralPeople′sHospital/FirstCollegeofClinicalMedicalScience,ThreeGorgesUniversity，Yichang,Hubei443000,China)

Objective To explore the effect and mechanism of curcumin on rat cerebral ischemia reperfusion injury.Methods The rat model of cerebral ischemia reperfusion injury was constructed by the suture-occluded method.The effects of curcumin on cerebral infarction range,cerebral water content,neurological symptoms,cerebral histopathological morphology and expressions of PI3K,AKT,p-AKT,m-TOR,MDA,CAT,GPX,SOD,Bcl-2,Bax,Caspase-3 and Cleavage-Caspase-3 were evaluated.Results Curcumin had the protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury,could alleviate the neurological symptoms,decreased the cerebral tissue pathological morphological changes and cerebral water content,in addition,which could alleviate the expressions of MDA,Bax,Cleavage-Caspase-3,IL-6,MCP-1 and TNF-α and increased the expressions of PI3K,p-AKT,mTOR,Bcl-2,Caspase-3,CAT,GPX and SOD.Conclusion The curcumin pretreatment has the significantly protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury,which may be associated with activating PI3K/AKT /mTOR signal pathway,while suppressing inflammation,apoptosis and oxidative stress.

curcumin；brain ischemia；reperfusion injury;inflammation;apoptosis;oxidative stress;PI3K/AKT/mTOR

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.006

湖北省宜昌市科技基金資助項(xiàng)目(A11301-05)。

蘭晶(1979-)，主治醫(yī)師，碩士，從事腦缺血再灌注損傷方面研究。

R285.5

A

1671-8348(2017)01-0036-04

2016-07-18

2016-09-08)