4 ℃冷藏對厭氧發酵接種物活性的影響

陳柳萌,勒系意,聶 紅,桂 倫,熊江花,俞 瑩,張 誠*

(1.江西省農業科學院 農業應用微生物研究所,江西 南昌 330200;2.江西師范大學 生命科學學院,江西 南昌 330022;3.江西省農業環境監測站,江西 南昌 330200)

4 ℃冷藏對厭氧發酵接種物活性的影響

陳柳萌1,勒系意2,聶 紅1,桂 倫1,熊江花3,俞 瑩3,張 誠1*

(1.江西省農業科學院 農業應用微生物研究所,江西 南昌 330200;2.江西師范大學 生命科學學院,江西 南昌 330022;3.江西省農業環境監測站,江西 南昌 330200)

設計3個冷藏組(7、14、21 d)和2個對照組(未處理、常溫21 d),通過厭氧發酵接種物的理化指標(pH值、VFA、TIC、NH4+-N)測定、菌落結構分析和厭氧發酵產甲烷能力測試,研究了4 ℃冷藏處理對厭氧發酵接種物活性的影響。結果表明:接種物在4 ℃冷藏過程中,代表產甲烷菌的優勢條帶隨冷藏時間的延長出現了亮度下降，并有少量條帶丟失的現象;其厭氧發酵產甲烷能力出現下降,前15 d的日產甲烷速率明顯低于未處理組的;但冷藏處理能夠減緩氨氮濃度的增高,有助于接種物的厭氧發酵活性的恢復。

冷藏；接種物；厭氧發酵；活性

厭氧發酵技術作為環境生物技術的核心之一[1],是通過微生物的活動來處理各類有機廢棄物(農業秸稈、城市垃圾、畜禽糞便與市政污泥),以實現改善環境質量的目的,與此同時還可生產優質、清潔的生物質能源用以替代傳統化石能源,這對于能源與環境的和諧發展有著極為重要的促進作用。

厭氧發酵接種物隨著厭氧發酵技術的廣泛應用而越來越受重視。相關研究表明,在厭氧發生器中投入接種物對厭氧發酵有明顯的促進作用[2-4]。大多沼氣工程也在實踐中通過接種厭氧發酵接種物來縮短反應器的啟動時間。但接種物中厭氧菌群因其體積小、易流失、對環境條件敏感等特點,在保藏、運輸環節中容易受損。因此,筆者從接種物的理化指標、菌落結構和厭氧產甲烷能力三個方面開展實驗,考察了4 ℃冷藏條件(基于微生物保藏需求與現代物流配送體系考慮)對厭氧發酵接種物活性的影響,以期為接種物的保藏運輸和工程應用提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

厭氧污泥:收集自江西省新余市羅坊沼氣站1號發酵罐,采用氮氣隔氧保存。發酵原料:選用金針菇菌包,收集自江西省農業科學院農業應用微生物研究所金針菇示范基地；將其陰干粉碎,4 ℃冷藏備用。

1.2 儀器設備

全自動產甲烷潛力分析測試系統(AMPTS II),由瑞典Bioprocess Control AB公司研發。該系統分為UNIT A(發酵單元)、UNIT B(酸性氣體吸附單元)、UNIT C(甲烷氣體計量單元)三個部分。A單元共有15個發酵瓶,每個發酵瓶配有可調轉速及攪拌頻率的機械攪拌系統;B單元共有15個吸收瓶,配有3 mol/L NaOH溶液以吸附沼氣中的酸性氣體；C單元內置模型和算法，結合溫度、壓力傳感器，弱化了水蒸氣和發酵瓶中高估氣體的量對實際產甲烷量的影響,最終記錄的甲烷氣體數值為轉換后的標準狀況(0 ℃、101.3 kPa)下的體積[5]。實驗溫度為37 ℃。

接種物的菌落結構分析與理化指標測定所涉及的主要儀器有:電熱鼓風干燥箱(上海安亭)、馬弗爐(沈陽節能)、PCR儀(BIORED)、DGGE(BIORED)、坩堝、電子天平、pH計(上海雷馳)、UV765紫外可見光光度計(上海精科)、酸式滴定管。

1.3 實驗方法

1.3.1 厭氧污泥與發酵原料理化指標的測定 接種物的理化指標包括固形物(TS)、揮發性固形物(VS)、C、N、小分子揮發酸(VFA)、氨氮(NH4+-N)含量，以及pH值和堿度(TIC)。

1.3.1.1 TS、VS含量 采用重量法進行測定。將坩堝洗凈后于干燥箱(105 ℃)內烘干,然后冷卻至室溫,稱重，記作m1(g);根據實驗材料的特性,準確稱量適量樣品，放置于坩堝內，一起稱重,記作m2(g);隨后將其放入干燥箱(105 ℃)內干燥至恒重,冷卻至室溫后稱重，記作m3(g);再將上一步裝有干燥后樣品的坩堝放入馬弗爐中，在550 ℃下灼燒2 h,冷卻至室溫后稱重，記作m4(g)。TS、VS含量的計算公式如下:

(1)

(2)

VS=TS-灰分含量

(3)

1.3.1.2 C、N含量 將接種物與發酵原料(金針菇廢棄物菌包)陰干，粉碎至粒徑小于1 mm,采用元素分析儀進行C、N含量的測定。

1.3.1.3 pH值 取樣后在30 min內采用pH計進行檢測。

圖6統計了貝塞爾高斯渦旋光束的光束抖動在不同各向異性的湍流大氣中隨傳輸距離的變化情況，其中各向異性參數設置分別為ξx=1，5，10和20.從圖6中可以發現隨著湍流各向異性參數的增大，貝塞爾高斯渦旋光束的抖動效應逐漸減弱，在遠距離傳輸時，該現象更加明顯.隨著湍流各向異性參數的減小，貝塞爾高斯渦旋光束的抖動效應增強，當各向異性參數都為1時抖動效應最強，此時大氣湍流譜退化為各向同性湍流譜.這是因為各向同性大氣模擬的是近地大氣湍流，各向異性大氣模擬的是高空大氣湍流，其高空大氣湍流對渦旋光束相位強度的擾動要弱于近地大氣湍流的擾動，因此導致了抖動效應隨各向異性參數的增大而減弱.

1.3.1.4 堿度(TIC)、小分子揮發酸(VFA)含量[6]TIC、VFA采用Nordmann聯合滴定法進行測定,其原理基于弱酸弱堿緩沖體系理論。即先過濾去除樣品中的顆粒雜質,然后取體積為V的樣品置于25 mL的高型燒杯中,采用0.05 mol/L稀H2SO4滴定至pH為5.0,記錄稀H2SO4溶液的消耗量,記作V1;繼續滴定至pH為4.4,記錄稀H2SO4溶液的消耗量,記作V2。VFA與TIC質量濃度的計算公式為:

(4)

(5)

上式中:CVFA為VFA質量濃度(以CH3COOH計)(mg/L)；CTIC為TIC質量濃度(以CaCO3計)(mg/L)。

1.3.1.5 氨氮(NH4+-N)含量 采用納氏試劑分光光度法[7]進行測定。先根據該方法制作氨氮的標準曲線,獲得其回歸方程為y=1.4621x+0.0028,R2=0.9995。

樣品測定操作步驟:(1)分取適量、經絮凝沉淀預處理后的水樣(使氨氮含量不超過0.1 mg),加入50 mL比色管中,稀釋至標線,加1.0 mL酒石酸鉀鈉溶液；以下操作同校準曲線的繪制。(2)分取適量、經蒸餾預處理的餾出液,加入50 mL比色管中,加一定量的1 mol/L氫氧化鈉溶液以中和硼酸,稀釋至標線,加1.5 mL納氏試劑,混勻。放置10 min后,用繪制校準曲線的相同步驟測量吸光度。(3)將第一步中的無氨水換成水樣,做全程序空白實驗測定。將測得的出水樣吸光度減去空白實驗的吸光度后,從校準曲線上查得氨氮量m。氨氮(NH4+-N)含量(mg/L)的計算公式如下:

(6)

式(6)中:m為由校準曲線查得的氨氮量(mg);V為樣品體積(mL)。

1.3.2 發酵物料(金針菇菌包)基本理化性質的測定 發酵物料的基本理化指標包括固形物(TS)、揮發性固形物(VS)、C、N含量,其檢測方法見1.3.1.1和1.3.1.2。

1.3.3 厭氧發酵接種物的制備 本實驗以羅坊沼氣站的厭氧污泥為基礎,進行厭氧發酵接種物的制備,方法如下:先將厭氧污泥稀釋至TS為6%左右,然后將其與活性炭(質量比1%)混合，最后將混合物裝入連續厭氧發酵裝置，進行連續厭氧發酵;以豬糞為原料,每天進料負荷為1 g/L,滯留期為30 d。待甲烷產量穩定,且發酵系統中各項指標(pH、TIC、VFA、NH4+-N)均符合實驗要求時,罐內的反應物即為本實驗所需的厭氧發酵接種物。

1.3.4 不同冷藏時間點接種物理化指標的檢測 將獲得的厭氧發酵接種物從發酵罐內取出,分裝于5個帶有氮氣隔氧保護的密閉容器內(該容器帶有自動排氣功能,可將接種物產生的沼氣排空)。其中3個處理為4 ℃冷藏組(7 d、14 d、21 d),2個處理為對照組(未處理,常溫21 d)。不同處理接種物的理化指標檢測方法見1.3.1。

1.3.5 不同處理接種物菌落結構的分析

1.3.5.1 基因組總DNA的提取 DNA的提取采用蛋白酶K法[8]。

1.3.5.2 PCR擴增 擴增對象為16S rDNA的V3可變區。對于古菌,引物對為：518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)、109F(5′-ACGGCTCAGTAACACGT-3′)。為了提高DGGE的分辨效率,在518R的5′端加GC(-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG

CACGGGGGG-)。

PCR反應體系:天根Mastermix 12.5 μL、引物各1 μL、模板2 μL,補加無菌ddH2O至25 μL。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。其中古菌PCR的反應條件為:94 ℃預變性4 min，然后94 ℃變性1 min,56 ℃退火37 s,72 ℃延伸1 min，最后72 ℃保溫10 min,35個循環。

1.3.5.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE) 聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%,細菌和古菌的變性劑濃度范圍分別是35%～65%和35%～50%。在1×TAE緩沖液中,先以220 V的電壓在60 ℃下預電泳10 min,然后以140 V電壓在60 ℃下恒溫電泳8 h。電泳結束后,進行硝酸銀染色并拍照。

1.3.6 不同冷藏時間對厭氧發酵接種物的厭氧產甲烷能力的影響 采用全自動產甲烷潛力分析測試系統(AMPTSII)進行不同處理接種物的厭氧發酵產甲烷實驗,每個實驗處理設3個重復。發酵實驗按VS接種物:VS物料=2∶1的比例啟動,以累積甲烷產量、產甲烷速率及發酵啟動率等為評價指標，考察不同處理接種物的厭氧發酵產甲烷能力。

2 結果與分析

2.1 實驗材料(厭氧污泥、金針菇菌包)的理化指標

由表1的檢測結果可知,從沼氣站取回的厭氧污泥基本性狀良好,VFA/TIC值為0.04(明顯小于風險臨界值0.4),這表明接種物中產酸菌與產甲烷菌之間的協調性良好,未有酸累積等情況發生。而接種物略微偏堿性(pH 8.11)，其氨氮值(6674 mg/L)略微偏高,這是厭氧污泥在長期的發酵過程中對豬糞物料適應的結果。因此厭氧污泥符合實驗需求,但需要進行復活處理后才能用于后續實驗。

當發酵原料的C/N較高時,發酵系統中微生物的生長繁殖會受到影響,使新陳代謝不充分而不能達到甲烷轉化的最大值;而當C/N較低時,氮的剩余會導致過多氨(NH3)的形成,進而導致整個微生物群體的完全癱瘓。因此,將發酵物料的C/N維持在(10～30)∶1可以確保發酵系統的穩定,這也是本實驗選擇擁有較佳C/N(24∶1)的金針菇菌包作為發酵原料的原因。

表1 實驗材料的理化指標檢測結果

注:金針菇菌包為固體形態,其pH值、TIC、VFA和NH4+-N不作檢測。

2.2 厭氧發酵接種物的制備結果

如圖1、圖2所示,當每天進料負荷VS為1 g/L時,厭氧發酵系統經過25 d的適應期后,甲烷產率與反應發酵系統的各項指標(pH、TIC、VFA、NH4+-N)也逐漸趨于穩定,而且均處于厭氧發酵所需的正常范圍內，其中: pH值約為7.52; VFA/TIC=0.08,遠小于系統風險臨界值0.4; NH4+-N含量也由最初的3518 mg/L降低至1328 mg/L。

圖1 厭氧發酵接種物的甲烷日產量及pH值的變化趨勢

圖2 厭氧發酵接種物在制備過程中主要指標的變化趨勢

2.3 冷藏處理對厭氧發酵接種物的理化指標的影響

如表2所示,經冷藏處理后,厭氧發酵接種物的pH值與TIC值沒有明顯的變化,但VFA值明顯降低(產甲烷菌以VFA為營養物質)，NH4+-N值明顯增高(水解菌降解N源)，這表明在接種物內存在物質代謝。其中:4 ℃冷藏處理使微生物菌群進入休眠狀態,減緩接種物內部營養物質的降解而維持一個相對穩定的狀態;而在常溫保藏條件下,微生物菌群仍以正常的生長速率消耗接種物中的營養物質,特別是隨著N源的分解,接種物內NH4+-N值大幅度上升。因此,4 ℃冷凍保藏比常溫保藏更能維持接種物內部環境的穩定狀態。

表2 不同實驗處理對厭氧發酵接種物的理化指標的影響

2.4 冷藏處理對接種物中產甲烷菌的菌落結構影響

接種物的核心是一個微生態群落,當環境改變(從發酵罐中取出)后,其菌落結構發生了相應改變(如圖3所示),電泳圖左側箭頭所指示的4個條帶在保藏過程中逐漸消失了,這表明上述條帶所代表的產甲烷菌對環境改變非常敏感;其余條帶盡管仍然存在,但條帶的亮度也隨冷藏時間的延長而出現不同程度的下降,這表明上述條帶代表的產甲烷菌盡管對環境改變具有一定的耐受力,但活性會逐漸下降。

圖3 不同冷藏時間點接種物產甲烷菌的菌落結構

2.5 冷藏時間對厭氧發酵接種物厭氧產甲烷能力的影響

由表3可知：常溫保藏的3個實驗重復雖能正常啟動,但均在產氣8 d后進入停滯狀態;而4 ℃冷藏則在一定程度上維持了接種物的活性,每個冷藏處理中均有1個實驗重復可順利產氣；但受影響不可避免,剩余2個4 ℃冷藏實驗重復基本上都在前23 d的恢復期內停止產氣。就整體而言,接種物的產甲烷能力隨冷藏時間的延長而下降。

表3 不同處理下厭氧發酵接種物產甲烷天數的統計結果 d

整合分析能順利產氣32 d的實驗組數據,我們發現:4 ℃冷藏較常溫保藏更能維持住接種物的厭氧產甲烷能力,但對該能力存有影響。如圖4、圖5所示,4 ℃冷藏(7、14、21 d)后的接種物在發酵中前期內的累積甲烷產量明顯低于未處理的對照組;但隨著厭氧發酵的進行,其累積甲烷產量呈現出逐漸追平的趨勢。這表明:接種物的活性需要時間恢復,讓厭氧發酵菌群從休眠狀態改出,進行菌群繁殖與菌落結構的適應性調整,進而逐步恢復其厭氧產甲烷能力。而常溫保藏組在產8 d甲烷后,發酵系統基本上進入停滯狀態,累積甲烷產量只有冷藏處理組的一半左右。結合表2數據分析可知:接種物內部環境條件對厭氧發酵菌群的恢復有明顯的影響,這也是冷凍保藏較常溫保藏的優勢所在。

圖4 冷藏處理對累積產甲烷量的影響

3 討論與結論

厭氧發酵接種物是沼氣工程啟動的關鍵,明確4 ℃冷藏對厭氧發酵接種物活性的影響,有助于改進接種物在保藏、運輸及工程上的應用。本實驗結果表明:接種物在4 ℃冷藏過程中,代表產甲烷菌的優勢條帶亮度隨冷藏時間的延長而下降，并出現了少量條帶丟失的現象;厭氧發酵產甲烷能力出現下降,前15 d的日產甲烷速率明顯低于未處理組的;但冷藏處理能夠減緩氨氮濃度的增高,有助于接種物的厭氧發酵活性的恢復,這是冷藏方式較常溫保藏的優勢所在。

圖5 冷藏處理對產甲烷速率的影響

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(責任編輯:黃榮華)

Effect of Cold Storage at 4 ℃ on Activity of Inoculum for Anaerobic Fermentation

CHEN Liu-meng1, LE Xi-yi2, NIE Hong1, GUI Lun1, XIONG Jiang-hua3, YU Ying3, ZHANG Cheng1*

(1. Institute of Applied Agricultural Microorganism, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; 2. School of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China; 3. Agricultural Environmental Monitoring Station of Jiangxi Province, Nanchang 330200, China)

In this study, the inoculum for anaerobic fermentation was stored under five different conditions formed by 3 cold (4 ℃) storage groups (7 d, 14 d, 21 d) and 2 control groups (untreated storage, room-temperature storage for 21 d), its physical and chemical properties (pH-value, VFA, TIC, and NH4+-N), colony structure and anaerobic methanogenesis ability were tested and analyzed, and the effect of cold storage at 4 ℃ on its activity was studied. The results showed that: during the cold storage of anaerobic fermentation inoculum at 4 ℃, the quantity and varieties of methanogens were declined, and their daily anaerobic methanogenesis rate at earlier 15-d stage was obviously lower than that in the untreated control group. However, the cold storage could reduce ammonia nitrogen concentration and contribute to the recovery of anaerobic fermentation activity of inoculum.

Cold storage; Inoculum; Anaerobic fermentation; Activity

2016-09-07

科技部國際科技合作項目(SQ2013Z0C500005);國家科技支撐計劃項目(2014BAC04B02);江西省重大項目(20152ACF6 0023);江西省科技廳對外合作技術項目(20141BDH80018)。

陳柳萌(1981─),男,江西贛州人,副研究員,碩士,主要從事農村能源方面的研究。*通訊作者:張誠。

TQ920.6

A

1001-8581(2017)01-0102-05