豬圓環病毒2型Cap基因的克隆與原核表達

楊克禮,時 代,段正贏,田永祥*,周丹娜,郭 銳,劉澤文,袁芳艷,劉 威,孟 麗

(1.湖北省農業科學院 畜牧獸醫研究所 動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430064;2.河南省信陽市浉河區畜牧局,河南 信陽464000)

豬圓環病毒2型Cap基因的克隆與原核表達

楊克禮1,時 代2,段正贏1,田永祥1*,周丹娜1,郭 銳1,劉澤文1,袁芳艷1,劉 威1,孟 麗1

(1.湖北省農業科學院 畜牧獸醫研究所 動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430064;2.河南省信陽市浉河區畜牧局,河南 信陽464000)

利用PCV2鄂州株的基因序列設計特異性引物,分別在上、下游引物中加入SacI和HindIII酶切位點,擴增出PCV2鄂州株的ORF2基因;將該片段克隆至pET-28a原核表達載體,經PCR、酶切鑒定,成功構建了陽性重組表達質粒pET-ORF2。將其轉入大腸桿菌Rosetta中,經IPTG誘導,SDS-PAGE電泳分析確定重組蛋白大小為34.5 kD,主要以包涵體的形式表達。優化后確定最佳誘導條件為:37 ℃,至OD值0.4～0.6時加入終濃度為1 mmol/L的 IPTG,誘導5 h。表達產物經His-tag鎳柱純化后進行Western-blot分析,結果表明表達的重組蛋白能夠與PCV2標準陽性血清發生特異性反應,具有良好的反應原性。

豬圓環病毒2型；Cap基因；克隆；原核表達

豬圓環病毒(Porcine circovirus, PCV)是目前已知的最小的病毒之一,可以分為PCV1和PCV2[1-2]。其中,PCV1沒有致病性,但感染之后可以產生抗體,廣泛存在于豬體內,在豬腎傳代細胞系中檢出率也非常高;PCV2則有很強的危害性,由其引發的PMWS在全世界范圍內都有流行[3],給養豬行業帶來了非常大的危害。PCV2引起的一系列疾病也給我國的養豬業造成了巨大的影響,帶來了嚴重的經濟損失[4]。

但是,目前尚無有效的應對PCV2的手段,無法很好地控制PCV2疫情的傳播[5]。隨著PCV2引起的相關疾病的流行情況日益嚴峻,提前判斷、及時掌握PCV2的流行趨勢就變得非常關鍵,研發一種PCV2快速簡便的診斷方法的需求非常迫切。

PCV有兩個最大的開放閱讀框，即ORF1和ORF2,它們分別編碼Rep和Cap蛋白[6]。兩種血清型病毒的Rep蛋白的同源性達到了86%,而Cap蛋白的同源性只有65%,且ORF2部分含有與病毒分型有關的抗原表位[7],因此,可以用來建立血清型檢測方法,用于檢測PCV2。

早期有研究人員利用截短的Cap蛋白建立了一種檢測PCV2的ELISA方法[8-9],但是截短后的基因不能完整地保留Cap蛋白的抗原性,因此在檢測過程中很可能會出現檢出率不高、漏檢等問題。本研究設計了一對特異性引物,成功擴增出PCV2鄂州株完整的ORF2基因片段,并將其連接到pET-28a載體,構建了原核表達質粒,誘導表達出完整的Cap蛋白,保留了其全部的抗原性，這為建立特異性強、檢出率高的檢測PCV2血清抗體的間接ELISA方法奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株

pET-28a載體、大腸桿菌E.coliDH5α菌株、PCV2鄂州株均由湖北省農業科學院保存；E.coliRosetta (DE3)感受態細胞購自北京康為世紀生物科技有限公司； pMD-18T載體購自大連寶生物公司。

1.2 主要試劑

限制性內切酶SacI、HindIII購自大連寶生物公司; Preminx Taq酶、DL 2000 Marker、DL 5000 Marker、1000 bp DNA ladder、His融合蛋白純化高親和力鎳填充樹脂購自北京康為世紀生物科技有限公司;基因組提取試劑盒購自Axygen公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、IPTG等均購自武漢創百科生物有限責任公司;其它化學試劑為國產分析純試劑,購自有關商業公司。

1.3 引物設計

根據本實驗室保存的PCV2 鄂州株的全基因測序結果,使用DNAMAN和Primer Premier 5.0軟件設計了1對引物,可以擴增出PCV2 ORF2的完整基因片段。分析pET-28a質粒圖譜,分別在上、下游引物設計了SacI和HindIII酶切位點。引物交由上海生工生物工程有限公司合成,將上、下游引物分別命名為P1、P2，其中P1為5′-CGAGCTCATGACGTATCCAAGGAGGC-3′(下劃線處為SacI酶切位點)；P2為5′-CCCAAGCTTTTAGGGTTTAAGTGGGGG-3′(下劃線處為HindIII酶切位點)。

1.4 病毒總DNA的提取

取本實驗室保藏的PCV2 HBEZ株病毒適量,利用病毒DNA提取試劑盒,按說明書操作抽提病毒DNA,立即用于PCR擴增或置-20 ℃冰箱保存備用。

1.5 擴增ORF2基因

以提取的PCV2 DNA為模板,用引物P1、P2擴增完整的ORF2基因片段； PCR反應體系為: Premix Taq 12.5 μL、上游引物P1 1 μL、下游引物P2 1 μL、DNA 3 μL、ddH2O 7.5 μL，總體積25 μL。

將上述PCR反應體系振蕩混勻后離心,在PCR儀器上按照如下反應程序進行擴增:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個循環;72 ℃ 10 min。反應結束后,取7 μL產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳進行檢測,拍照并記錄反應結果。

1.6 PCR產物的回收與純化

利用凝膠回收試劑盒，按照說明書操作，進行PCR產物的回收與純化。

1.7 重組表達質粒的構建與鑒定

分別用SacI、HindIII雙酶切pMD-ORF2質粒和提取的pET-28a載體質粒；酶切產物經膠回收后,用Solution I在16 ℃下連接過夜,將ORF2基因插入表達載體pET-28a上。取5 μL連接產物，轉化至100 μL大腸桿菌Rosetta感受態細胞中。挑取單個菌落培養,提取質粒,分別做PCR及酶切鑒定,選取陽性質粒,送至上海生工生物工程有限公司進一步測序確證,將陽性重組表達質粒命名為pET-ORF2。

1.8 重組蛋白的誘導表達

1.8.1 IPTG誘導表達 挑取鑒定正確的pET-ORF2單菌落,接種于5 mL含有100 mg/mL的Kan抗性LB液體培養基中，在37 ℃下以200 r/min振蕩培養過夜；之后,按照1∶100比例接種Kan/LB液體培養基,37 ℃ 200 r/min培養約3 h,待OD600值為0.6～0.8時,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG開始誘導表達,同時設置空載體菌誘導和未誘導對照。誘導5 h后,取1 mL菌液于EP管中,處理后進行SDS-PAGE分析。

1.8.2 IPTG濃度的優化 按照上述方法誘導重組蛋白的表達,加入不同終濃度的IPTG,分別設置0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L四個不同濃度,其余條件相同；待培養5 h后,分別取1 mL菌液于EP管中,處理后進行SDS-PAGE分析。

1.8.3 誘導時間的優化 按照上述方法誘導重組蛋白的表達,加入確定的最佳濃度的IPTG開始誘導,在相同條件下繼續培養,分別于誘導后3、4、5、6 h時在無菌環境下取1 mL誘導菌液于EP管中,處理后進行SDS-PAGE分析。

1.9 重組蛋白的可溶性分析

收集1 mL誘導后的菌液,在4 ℃下以12000 r/min離心5 min,收集重組菌體,漩渦振蕩懸浮菌體,冰浴中進行超聲波破碎,每次超聲2 s,間隔2 s,裂解至菌液至澄清。將裂解后的菌液于4 ℃下以12000 r/min離心5 min,分別收集上清和沉淀。向沉淀中加入和上清等體積的PBS重懸,然后加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液,混勻后煮沸10 min,在4 ℃下冷卻2 min,然后以12000 r/min離心1 min。取10 μL進行SDS-PAGE電泳分析。

1.10 重組蛋白的純化

大量誘導表達重組蛋白,將溶解后的包涵體溶液利用康為世紀His-tag融合蛋白純化高親和力鎳填充樹脂按照說明書方法進行純化。收集目的蛋白洗脫液,用SDS-PAGE檢測蛋白純度,用紫外分光光度計測定純化后蛋白質的濃度。

1.11 Western Blotting分析

取純化Cap蛋白進行SDS-PAGE電泳后,取下凝膠,不經考馬斯亮藍染色,直接將蛋白電轉印至硝酸纖維素膜上,用5%的脫脂奶粉在37 ℃下封閉2 h,用TBST洗滌3～5次;用1∶100稀釋的抗PCV2陽性血清作為一抗，在37 ℃下孵育1～2 h,用TBST洗滌3～5次;放入1∶2000稀釋的二抗(HRP標記過的羊抗豬IgG)稀釋溶液中,在37 ℃下作用1～2 h,用TBST洗滌3～5次;將NC膜進入底物液中,避光顯色5 min左右,至目的條帶清晰可見且背景顏色不深時,加入去離子水,終止反應。

2 結果與分析

2.1 ORF2基因的擴增結果

用設計的引物,從提取的病毒總DNA中特異性擴增PCV2 ORF2基因,經瓊脂糖凝膠電泳檢測,可見大小為720 bp的目的基因條帶,與預計片段大小一致,且無其它雜帶(見圖1)。

M: DL 2000 Marker; 1～4: PCV2 ORF2基因擴增產物。

2.2 克隆質粒的構建和鑒定

將擴增的ORF2基因和pMD-18T載體連接后,連接產物轉化DH5α后,小量提取克隆質粒,進行PCR鑒定,獲得與ORF2基因預期大小相同(720 bp)的目的片段；經SacI/HindIII雙酶切鑒定,獲得了兩條條帶,分別為2600 bp和720 bp,與預期大小相同。對測序結果進行分析，結果表明pMD-ORF2構建成功,且讀碼框完全正確(見圖2)。

M1: DL 5000 Marker; M2: DL 2000 Marker; 1:pMD-ORF2雙酶切產物; 2: pMD-ORF2質粒PCR產物。

2.3 重組表達質粒的構建與鑒定

使用SacI/HindIII酶從測序正確的克隆質粒pMD-ORF2中切下ORF2基因片段,切膠回收后和同樣經過SacI/HindIII雙酶切的pET-28a載體片段經Solution I連接，然后將其轉化入Rosetta(DE3),小量提取質粒,經雙酶切鑒定,獲得了4900 bp和720 bp大小的兩條條帶,與預期大小相同。測序結果分析表明,表達載體pET-ORF2構建成功(見圖3)。

M1: DL 2000 Marker; M2:1000 bp DNA ladder;1～4: pET-ORF2雙酶切產物。

2.4 目的基因的誘導表達與分析

將重組菌接種于Kan/LB培養基,在37 ℃下振蕩培養,經過IPTG誘導表達后,收集表達菌體,處理后進行SDS-PAGE電泳分析。由圖4可見，重組菌在34.5 kD處有明顯的表達條帶,與預期的蛋白分子量大小一致。

M:低分子量蛋白Marker; 1:空載體pET-28a誘導4 h后產物;

2.5 誘導劑IPTG濃度的確定

SDS-PAGE分析結果顯示，當IPTG濃度為1.0 mmol/L時,表達量最大(見圖5)。

M:低分子量蛋白Marker; 1～4:誘導劑終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L時誘導5 h后的產物。

圖5 不同濃度誘導劑IPTG誘導重組蛋白產物SDS-PAGE分析結果

2.6 IPTG誘導時間的優化和可溶性結果

使用1.0 mmol/L IPTG開始誘導菌液,分別于誘導后3、4、5、6 h時,在無菌環境下取1 mL誘導菌液于EP管中,菌液處理后進行SDS-PAGE電泳分析。結果表明,蛋白的表達量在誘導開始后一段時間內隨著誘導時間的增加而增加,但當到達一定時間后,目的蛋白的表達量增加不再明顯,重組蛋白在誘導5 h后獲得了較高的蛋白表達(見圖6)。

根據確定的最佳IPTG誘導濃度和最佳誘導時間誘導重組菌表達,經過超聲波破碎得到了包涵體沉淀和上清。向包涵體中加入和上清同體積的PBS重懸,處理后進行SDS-PAGE電泳分析,結果表明，Cap蛋白以包涵體的形式表達,在上清中表達量很少。

M:低分子量蛋白Marker; 1:誘導前重組蛋白; 2～5:重組蛋白誘導后3、4、5、6 h的表達產物; 6:上清樣品; 7:包涵體樣品。

圖6 不同誘導時間誘導的重組蛋白及可溶性分析結果

2.7 重組蛋白的純化與鑒定

按照確定的最佳誘導劑濃度和誘導時間,大量表達目的蛋白,收集菌體,經超聲波破碎處理之后,棄上清,加入Inclusion Body Binding Buffer溶解包涵體。將溶解后的蛋白溶液通過His-tag融合蛋白純化高親和力鎳填充樹脂,按照說明書操作,純化目的蛋白,純化完成后,進行SDS-PAGE檢測，結果顯示獲得了純度較高的單一的Cap蛋白條帶(見圖7)。

M:低分子量蛋白Marker; 1:穿流液;2:純化前蛋白; 3:純化后蛋白。

圖7 His標簽重組蛋白NI柱純化產物SDS-PAGE分析結果

對純化后的重組Cap蛋白及空載體pET-28a誘導表達產物進行Western Blotting檢測分析,檢測結果顯示,重組蛋白在大約34.5 kD處出現單一的特異性條帶,而pET-28a空載體誘導的菌體蛋白沒有出現任何條帶。表明重組Cap蛋白正確表達和純化(見圖8)。使用紫外分光光度計測定純化后的蛋白濃度,結果為0.46 mg/mL。

M:低分子量蛋白Marker; 1:空載體pET-28a誘導產物; 2:純化后重組蛋白。

圖8 純化后重組蛋白Western-Blot分析結果

3 討論

PCV兩種基因型之間ORF1所編碼的Rep蛋白的同源性達到了86%,這就使得兩種基因型之間存在抗原交叉性,因此若用全病毒作為抗原來檢測抗體,就不能很好地區別出兩種基因型的感染。PCV2感染不會導致細胞病變,對宿主細胞的感染程度和感染率都維持在比較低的水平,由于病毒體積很小,使得細胞培養和純化都比較困難。所以,使用PCV2全病毒作為診斷抗原的難度也比較大。有關研究表明,兩種基因型的ORF2段基因同源性較低,且在PCV2 ORF2基因中存在4個主要抗原位點，其中的2個位點都是針對PCV2的特異性位點[10],可以有效地區分出PCV1和PCV2,由ORF2編碼的Cap蛋白在兩者之間沒有抗原交叉性。

Cap蛋白是病毒的衣殼蛋白,可以通過原核表達系統進行表達。對ORF2序列的分析發現,在其氨基端的核定位序列的41個密碼子中存在11個大腸桿菌的稀有密碼子；有資料顯示,稀有密碼子的存在會影響外源基因的表達[11]。前期有學者通過去除ORF2氨基端的稀有密碼子,通過在BL21大腸桿菌表達系統獲得了具有一定抗原性的截短Cap蛋白[12]。截短表達雖然降低了表達的難度,但它是一種探索性研究,截掉的基因如果存在抗原位點,則會導致獲得的截短表達蛋白免疫學功能的缺失。因為沒有保留Cap蛋白完整的抗原性,因此用截短的Cap蛋白作為抗原建立ELISA方法,會出現PCV2檢出率和準確率降低等問題。

筆者先后嘗試使用幾種表達菌株進行表達,結果發現將表達質粒pET-ORF2轉化入大腸桿菌Rosetta菌株,通過優化誘導條件,能夠獲得完整表達的Cap蛋白,這樣就可以完整地保留Cap全部的抗原性[13]。以此Cap蛋白包被酶標板,建立特異性檢測PCV2的ELISA方法,與截短的Cap蛋白相比,此全長Cap蛋白是更為理想的包被抗原。

PCV2 ORF2表達的Cap蛋白氨基端有稀有密碼子的存在,利用普通大腸桿菌(BL21)表達系統無法表達出完整的Cap蛋白。韓凌霞等對截短型Cap蛋白表達進行了研究,將Cap基因羧基部分連接到pGEX-6p-1載體,導入BL21感受態細胞,表達出了具有部分抗原性的截短Cap蛋白[14]。為了獲得完整的Cap蛋白,本研究將含有完整ORF2基因的表達質粒pET-ORF2導入Rosetta感受態細胞,在37 ℃下利用IPTG誘導可以表達出完整的Cap蛋白。進一步研究確定,在IPTG終濃度1 mmol/L、溫度37 ℃條件下誘導5 h, Cap蛋白的表達量最高。

本研究發現,表達出的PCV2 Cap蛋白是以包涵體的形式存在的,具有免疫學活性,可以用于進一步的試驗研究。在目前PCV2流行的嚴峻形勢下,未發現PCV2感染的豬場應制定合理的免疫程序,做好消毒工作,嚴密監視；如果出現陽性感染病例,則應及時淘汰病豬并作無害化處理;對于PCV2污染豬場,應根據養殖場的實際情況,制定凈化方案,避免PCV2的進一步傳播。

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(責任編輯:黃榮華)

Cloning and Prokaryotic Expression of GeneCapin Porcine Circovirus Type 2

YANG Ke-li1, SHI Dai2, DUAN Zheng-ying1, TIAN Yong-xiang1*, ZHOU Dan-na1,GUO Rui1, LIU Ze-wen1, YUAN Fang-yan1, LIU Wei1, MENG Li1

(1. Hubei Provincial Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding, Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China; 2. Shihe Animal Husbandry Bureau of Xinyang City in Henan Province, Xinyang 464000, China)

According to the complete genome of Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) strain HBEZ, a pair of specific primers were designed to amplifyORF2 gene in HBEZ, andSacIandHindIIIwere used in the primers.ORF2 gene fragment was cloned to the prokaryotic expression vector pET-28a to construct the recombinant plasmid pET-ORF2. PCR and restrict enzyme identification confirmed that the recombinant plasmid was constructed successfully. Then pET-ORF2 was transformed intoE.colistrain Rosetta. After being induced by IPTG, the recombinant protein with the molecular weight of 34.5 kD could express mainly in the form of inclusion body in SDS-PAGE electrophoresis. The best inducement conditions were acquired as follows: bacterial culture at 37 ℃, adding 1 mmol/L IPTG when the OD-value was between 0.4 and 0.6, and inducement by IPTG for 5 h. The expression product Cap protein was purified by His-tag Ni-column and then was examined by Western-blot. The results showed that the expressed recombinant protein could react specifically with the polyclonal antibody against PCV2, and it possessed a good reactogenicity.

Porcine circovirus type 2; GeneCap; Cloning; Prokaryotic expression

2016-07-12

科技部重點專項課題(2016YFD0500703);湖北省農業科技創新中心項目(2016-620-000-001-026);湖北省科技支撐計 劃(公益性科技研究類)項目(2014BKB063);動物胚胎及分子育種湖北省重點實驗室開放課題(2016ZD156)。

楊克禮(1976─),男,安徽懷遠人,副研究員,研究方向為動物傳染病。*通訊作者:田永祥。

S852.659.2

A

1001-8581(2017)01-0096-06