微滴式數字聚合酶鏈式反應精準定量檢測羊肉中摻雜豬肉

任君安，鄧婷婷，黃文勝，葛毅強，陳 穎,*

微滴式數字聚合酶鏈式反應精準定量檢測羊肉中摻雜豬肉

任君安1,2，鄧婷婷2，黃文勝2，葛毅強1,3，陳 穎2,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.中國農村技術開發中心，北京 100045）

以羊和豬的單拷貝持家基因DNA復制蛋白A1為靶基因設計合成了適用于微滴式數字聚合酶鏈式反應的特異性引物和探針，通過理論推導獲得了單位質量兩種肉基因拷貝數之比的固定值，并進行了驗證，據此將樣品中羊肉和豬肉的拷貝數轉換為相對質量分數，從而建立了羊肉中摻雜豬肉的精準定量檢測方法。該方法可以很好地應用于羊肉中摻雜豬肉的含量檢測，豬肉的最低定量限為1%，在5%～80%范圍內絕對誤差小于±1.30%，相對誤差小于±10%，定量結果準確、重復性高，可以為肉類摻假的監管工作提供有力的技術參考。

羊肉；豬肉；精準定量；微滴式數字聚合酶鏈式反應

近年來，世界各地肉制品摻假情況頻繁發生，2013年，歐洲多國在部分牛肉產品中檢出馬肉成分，爆發了所謂的馬肉風波[1]。在我國，隨著生活質量的提高，人們對動物蛋白的需求也日益增加，食用蛋白質含量相對較高的牛羊肉成了新的發展趨勢[2]。與此同時，肉類產品標注信息與實際不符的情況也隨之而來，如用豬肉等營養價值較低的廉價肉類摻入或代替羊肉等[3]。這種摻假行為不僅擾亂肉業市場秩序，損害消費者利益，甚至可能侵犯消費者的宗教信仰[4-5]。為保護消費者權益，全球不同國家和地區對肉制品的標識做了一系列規定。歐盟定量成分聲明強制要求肉制品需要標識出所有成分及其凈含量，并規定肉的主要成分為骨骼肌，結締組織和脂肪等成分需單獨列出且規定了最高含量，這是最嚴格的肉類成分標識制度[6]。目前，肉制品中動物物種成分的檢測多集中在定性或半定量檢測方面[7-10]，然而隨著摻假手段的不斷變化，實際應用中對肉制品真實含量的檢測需求卻越來越多，定量檢測逐漸成為了新的發展趨勢。Iwobi等[11]通過構建哺乳動物和禽類的內標基因，以物種特異基因和通用內標基因的Ct值比值完成對不同物種的定量檢測。López-Andreo等[12]通過構建等質量的多種肉混合樣品，進行了混合樣品中各種肉質量分數的定量。然而這些方法均采用的是實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，通過擴增獲得的Ct值推導出各個基因的拷貝數，并以此轉化為肉的質量。但該Ct值受PCR擴增效率及DNA溶液中雜質的影響，由此值推導出的基因拷貝數與樣品中的實際基因拷貝數偏差較大，從而加大了定量結果的偏差。

微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近幾年在實時熒光PCR基礎上發展起來的定量技術，可直接測得樣品中目標基因的絕對拷貝數，目前已應用于基因表達量[13]、微生物豐度[14]、轉基因產品含量[15]及食品成分的定量檢測[16]。René等[17]以轉基因大豆為樣品，比較了多重實時熒光PCR反應與微滴數字PCR反應，發現微滴數字PCR定量的不確定度低于17%，效果優于實時熒光PCR。

目前，已有學者將ddPCR應用于肉類摻假的定量[18-19]，然而，肉類定量檢測難點在于如何將PCR擴增得到的基因拷貝數轉換成肉的質量。這是因為不同種肉的細胞密度（每克組織中的細胞數量）和基因組大小不同，即便是等質量不同肉種其DNA得率（基因拷貝數）也不同。若直接將其拷貝數之比作為質量之比，結果會出現較大偏差[20]。Cai Yicun[18]和苗麗[19]等采用數字PCR方法，先將基因拷貝數轉換為DNA質量，再從DNA質量換算為肉的質量。由于該方法需要建立兩組標準曲線，實驗步驟繁瑣、工作量大，且進行兩步轉化，實驗誤差加大。

本實驗以單拷貝持家基因D N A復制蛋白A（replication protein A，RPA1）為靶基因，開展了豬肉、羊肉摻假的ddPCR定量檢測研究。通過理論推導獲得單位質量兩種肉的基因拷貝數之比的固定值，通過實驗驗證了不同含量肉種該值的穩定性，并利用該值實現了基因拷貝數比與質量比的轉換，建立了羊肉中摻雜豬肉成分的精準定量檢測方法，以期為肉制品摻假定量檢測標準的制定，為肉制品市場監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊、牛、驢、豬、雞、鴨、鵝、火雞、兔等肉類樣品以及羊肉串、羊肉餃子、羊肉卷、醬羊蹄、羊肉腸和孜然羊肉粒 市售；狐貍、狗、馬等樣品來自本實驗室。

擴增預混液（ddPCRTMSupermix for probes）、微滴生成專用油、微滴生成卡 美國Bio-Rad公司；引物和探針 英濰捷基（上海）貿易有限公司；其他常用化學試劑均為國產分析純 北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

Bio-Rad QX200 ddPCR生成儀和讀數儀、T100 PCR儀美國Bio-Rad公司；高速離心機 美國Thermo公司；組織研磨機 美國Qiagen公司；紫外分光光度計 德國Eppendorf公司；電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；絞肉機 上海西貝樂電器公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

豬羊混合樣品制備：取羊和豬的背長肌，分別用絞肉機絞碎。稱取豬肉20 g和羊肉5 g，將兩者均勻混合配制成含有80%豬肉成分的羊肉樣品；將上述樣品與羊肉按照3∶1的比例混合配制成含有60%的豬肉成分的羊肉樣品。同樣地，依次配制成含有50%、30%、10%、5%和1%豬肉成分的羊肉樣品，參照Wang Wei等[21]的方法提取DNA。

市售羊肉樣品制備：稱取羊肉串、羊肉餃子餡、羊肉卷、羊肉腸和孜然羊肉粒各20 g，用絞肉機絞碎，從中稱取200 mg，參照Wang Wei等[21]的方法提取DNA。

1.3.2 引物與探針的設計

根據GenBank中公布的牛、驢、雞、鴨、鵝、火雞、兔、狐貍、狗、馬、山羊、綿羊和豬等13個物種的持家基因RPA1基因DNA序列，進行同源序列比對，運用Primer Express 5.0軟件，在羊和豬的特異性區域設計數字PCR引物和探針。引物和探針序列見表1。

表1 引物和探針序列Table1 Primer and probe sequences for ddPCR assays

1.3.3 數字PCR檢測

ddPCR反應體系為：ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），探針0.5 μL（10 μmol/L），DNA模板（10～100 ng/μL）5 μL，加雙蒸水補足總體積至20 μL。反應體系充分混勻后加入微滴生成卡中，油包水微滴生成按照廠家的操作說明進行。

將生成的微滴全部轉入96 孔PCR反應板中，進行擴增。PCR包括3 個步驟：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，45個循環；98 ℃固化微滴10 min。最后用微滴分析儀對擴增產物進行計數分析。

1.3.4 單位質量羊肉與豬肉基因拷貝數比值的確定和驗證

肉的質量與樣品DNA溶液中RPA1的基因拷貝數及單位質量的基因拷貝數有關，如式（1）所示：

式中：M為肉的質量；Q為基因拷貝數；C為單位質量肉的基因拷貝數。因此，不同肉種的質量比則應為式（2）：

式中：Mp和Mm分別為豬肉和羊肉的質量；Qp和Qm分別為混合樣品中豬肉和羊肉的基因拷貝數；Cp和Cm分別為單位質量豬肉和羊肉的基因拷貝數。

由于同一肉種的細胞密度和基因組大小是固定的，因此，對任何肉種而言，其Cm/Cp均為常數。只要測得混合樣品中各成分的基因拷貝數，結合Cm/Cp這一常數，即可計算出混合肉樣中各組分的比例。

為計算Cm/Cp，采用數字PCR分別定量檢測豬肉含量為1%、10%、50%、60%和80%的羊肉樣品中兩種肉的RPA1基因拷貝數，并計算Cm/Cp和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

3.身體和環境是認知的構成。傳統認知心理學并不否認環境在認知過程中的作用，但具身認知理論認為身體和世界在認知加工中扮演了某種構成性的（constitutive）的角色，而不僅僅是因果作用的角色［2］，即身體和環境不僅僅是認知的因果關系，更是認知的構成部分，其造就了某種認知的結果。

為進一步確定Cm/Cp在單一質量下的準確性和穩定性，稱取6 份50%豬肉含量的羊肉樣品，根據1.3.1節進行樣品處理并提取基因組DNA，通過建立的數字PCR擴增體系，測得豬肉和羊肉的RPA1基因拷貝數，每份混合樣品重復3 次，分別取豬肉和羊肉基因拷貝數的平均值計算其比值，并以此計算Cm/Cp和RSD。

1.3.5 定量線性范圍和方法的重復性和準確性驗證

采用1.3.4節確定的單位質量下羊肉與豬肉基因拷貝數之比，將數字PCR測得的豬肉含量為1%～80%的樣品中豬肉和羊肉的拷貝數分別轉換為質量分數，并以測量值和真實值做線性范圍關系曲線，并計算其相關系數R2。

以10%、5%和1%豬肉含量的羊肉樣品為模擬樣品，每個樣品重復6 次，同時檢測豬肉和羊肉RPA1基因拷貝數，并通過確定的Cm/Cp將其轉化為質量分數，計算各樣品6 次重復的平均值、RSD、絕對誤差和相對誤差，確定定量方法的準確性和重復性。

1.3.6 市售羊肉樣品的檢測

14 份市售羊肉樣品（包括羊肉串、羊肉餃子、羊肉卷、羊肉腸、孜然羊肉粒）提取DNA，用建立的ddPCR擴增體系，測得樣品中羊和豬RPA1基因拷貝數，并通過1.3.4節確定的單位質量下豬肉與羊肉拷貝數的比值計算其質量百分比。

2 結果與分析

2.1 引物探針特異性實驗

圖1 羊特異性引物探針數字PCR篩選Fig. 1 Screening of mutton- and goat-specific primers and probes

圖2 豬特異性引物探針數字PCR篩選Fig. 2 Screening of pork-specific primers and probes

通過數字PCR對羊肉、豬肉等13 種肉類的DNA擴增結果顯示，羊的引物探針特異性良好，可以同時擴增出綿羊肉和山羊肉，且其他肉類樣品均沒有擴增（圖1）；豬肉的引物探針只對目標樣品豬肉有擴增，其余12 種肉類樣品均沒有擴增（圖2）。以上結果說明表1中的引物和探針均能有效擴增靶標物種的RPA1基因，且對其他非目標物種無擴增。兩組引物探針的特異性良好，可以用于后續的ddPCR定量檢測實驗。

分別檢測豬肉含量為1%、10%、50%、60%和80%的5 個樣品中豬、羊肉的RPA1基因拷貝數，并計算豬肉與羊肉二者的質量比與基因拷貝數之比的比值（表2）。結果表明，5 個不同豬肉含量樣品的Cm/Cp平均值為1.84，RSD為3.50%，Cm/Cp的穩定性較高。因此實驗證明，無論羊肉和豬肉含量如何變化，Cm/Cp一直為1.84穩定不變。

表2 不同豬肉含量時的Cm與Cp及Cm/CpTable2 The ratio of copy numbers of unit mass in different pork proporttiioonnss

表 33 5500%豬肉含量時Cm和Cp及Cm/CpTable3 Copy numbers per unit mass of pork and mutton and their ratios att 5500% pork content

為進一步驗證Cm/Cp的準確性和穩定性，采用建立的數字PCR體系，分別檢測6 份50%豬肉含量的平行樣品中豬肉和羊肉RPA1基因拷貝數的3 次均值，計算等質量條件下兩種肉基因拷貝數的比值Cm/Cp，并計算6 份平行樣品的Cm/Cp均值。結果顯示，單位質量下羊肉與豬肉拷貝數之比為1.84，6份平行樣品的結果穩定，RSD在1%以內，沒有顯著性差異（P＞0.05）（表3）。因此，不論羊肉與豬肉含量產生變化還是單一質量多次重復，單位質量條件下Cm/Cp均為1.84，利用該比值可以將基因拷貝數轉換為質量分數。

2.3 定量線性范圍、準確度和重復性實驗結果

圖3 豬、羊混合模擬樣品中豬肉含量的定量線性范圍Fig. 3 Linear quantitation range of pork content in binary mixture

為了驗證方法的準確度和重復性，選擇豬肉含量為10%、5%和1%的豬、羊低濃度混合樣品進行定量準確度和重復性實驗，每個樣品重復檢測6 次，結果見表4結果表明：豬肉含量為10%的樣品實際測量平均值為9.96%，相對誤差為－0.41%，RSD為4.59%；5%樣品豬肉含量實際測量平均值為4.62%，誤差為－7.51%，RSD為6.68%；1%樣品豬肉含量實際測量平均值為1.17%，RSD為9.73%。豬肉含量為10%和5%的樣品相對誤差低于±7.51%，1%樣品的相對誤差為16.82%，由于目前摻假行為多是經濟利益驅動型摻假，摻假含量較高，因此該方法符合常見摻假事件的定量檢測。此外，3 組低含量樣品中豬肉含量的RSD均小于10%，遠低于國際食品法典委員會關于食品定性和定量檢測方法標準指導方針中所規定的標準（＜25%）[22]，定量重復性符合食品打假執法的需要。

表4 羊肉中摻雜豬肉成分的定量準確度和重復性分析Table4 Quantitative accuracy and repeatability of pork content incorporated into mutton

2.4 市售羊肉制品的定量檢測

采用本實驗建立的方法檢測市售羊肉串、羊肉餡、羊肉卷、羊肉餡餃子以及羊肉腸等14 份標識為純羊肉制品中的羊肉和豬肉的相對含量，結果表明所有樣品經DNA提取和微滴數字PCR擴增后，均能夠檢測出羊肉和/或豬肉含量（表5）。羊肉餡、羊肉串、羊肉餡餃子和羊肉腸中檢測出豬肉成分，占樣品總數的35.7%。其中，12號樣品羊肉腸中未見羊肉成分，只有豬肉，1號和7號樣品中除了羊肉，還添加有20%～60%的豬肉。11號和14號樣品檢出的豬肉含量低于本方法的定量低限，推斷可能是污染導致。

表5 市售羊肉制品中羊肉和豬肉成分相對含量的檢測結果Table5 The relative contents of pork and mutton in commercial samples assayed by the ddPCR method

3 討 論

數字PCR在定量檢測方面精準度更高，與基于標準曲線的實時熒光PCR相比，數字PCR技術使用終點法檢測，不依賴于Ct值（熒光強度達到指定值時的PCR循環數），是一種可以測定絕對拷貝數的DNA精確定量技術，避免了不同樣品之間的擴增效率變化而導致的定量結果不準確[15]。K?ppel等[23]報道的實時熒光PCR方法在最低含量為1%時的相對誤差最高為65%。與之相比，本方法能準確獲得靶基因的絕對拷貝數并轉化為其質量分數，因此在最低檢測限為1%時的相對誤差更小，低于17%，有效提高了定量的檢測低限及其準確性。

本研究選擇單拷貝持家基因作為目的基因，其拷貝數不會因物種性別、年齡和部位發生變化，是良好的定量靶標，確保了定量的準確度和穩定性。Floren等[16]以ddPCR技術為基礎，分別選用線粒體cyt b基因和單拷貝持家基因作為靶標設計引物探針，發現多拷貝的線粒體基因在同種肉的不同組織中差異為6 倍。而Rodriguez等[24]也發現，動物的性別、年齡或組織器官的不同也會影響線粒體DNA豐度，而單拷貝持家基因在所有細胞中拷貝數恒定，其數量與樣品質量有較好的線性關系。

在肉類定量檢測中，除了需要準確獲得靶基因的絕對拷貝數外，將測得的靶基因相對豐度轉換為相應的質量分數也是準確定量的關鍵之處。本研究通過理論推導結合實驗驗證后得到了單位質量下兩種肉的基因拷貝數之比為一固定值，而K?ppel等[23]學者通過實時熒光PCR得到的Ct值推測出各物種基因拷貝數與其所占質量分數呈正相關，與本實驗研究結果吻合。苗麗等[19]建立的ddPCR方法也可將基因拷貝數轉換為質量，但其為兩步轉換，加大了定量誤差，最低可定量到5 mg（5%含量）樣品時，誤差最高達13.2%。本研究建立的方法利用兩種肉基因拷貝數之比這一固定值，一步實現了基因拷貝數之比與質量之比的轉化，在定量5%豬肉含量時的相對誤差為－7.5%，且最低定量檢測限為1%，既簡化了實驗步驟，又提高了定量的準確性和檢測低限。

ddPCR為肉制品摻假精準定量提供了有力的技術手段，本研究表明通過理論推導并結合實驗驗證了單位質量下豬肉與羊肉拷貝數之比，使數字PCR測得的基因拷貝數可以直接轉換為各組分的質量分數，定量結果準確。本實驗所建立的方法不僅可以定量羊肉中摻雜豬肉，也可以應用于其他肉類及其他食品摻假的定量檢測，為執法部門判定肉產品及其他食品中摻假還是無意污染、打擊食品摻假現象及食品安全犯罪量刑等提供技術支撐。隨著數字PCR技術的日益發展，定量檢測食品中的動物源性成分將會成為我國行業標準發展的必然趨勢，為我國肉制品摻假的市場監管和相關執法提供有力的技術保障。

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A Precise Quantitative Assay for Measuring Pork Incorporated into Mutton Products by Droplet Digital PCR

REN Jun’an1,2, DENG Tingting2, HUANG Wensheng2, GE Yiqiang1,3, CHEN Ying2,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China; 3. China Rural Technology Development Center, Beijing 100045, China)

The adulteration of meat products happened frequently in recent years, and authentication of meat products is necessary to protect consumers from an inferior product with a false description. Although at present, there are numerous qualitative methods for meat species identification, fewer quantitative detection methods have been reported. Herein, a droplet digital PCR method for the quantitative determination of pork incorporated in mutton products was developed. The single copy house-keeping gene encoding replication protein A1 (PRA1) was chosen as the target to design species-specific primers and probes for mutton and pig, respetively. Each assay was proved specific to the target species, respectively. The ratio constants between copy numbers and unit mass of pork and mutton were obtained by theoretical analysis and then verified by experiments. Consequently, the relative mass fractions of pork and mutton in the sample were measured based on the DNA copy numbers. The limit of quantitation (LOQ) of the method was confirmed to be 1%. The results showed that the absolute error was less than ±1.3%, and the relative error was less than ±10% in the range of pork proportion from 5% to 80%. The method developed in this paper was successfully applied to quantitate pork content incorporated into commercial mutton products and it may be useful for food administration laboratories to carry out meat species quantification in raw and processed foods.

mutton; pork; quantitative determination; droplet digital PCR (ddPCR)

10.7506/spkx1002-6630-201702049

TS207.3

A

1002-6630（2017）02-0311-06

任君安, 鄧婷婷, 黃文勝, 等. 微滴式數字聚合酶鏈式反應精準定量檢測羊肉中摻雜豬肉[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 311-316. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702049. http://www.spkx.net.cn

REN Jun’an, DENG Tingting, HUANG Wensheng, et al. A precise quantitative assay for measuring pork incorporated into mutton products by droplet digital PCR[J]. Food Science, 2017, 38(2): 311-316. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702049. http://www.spkx.net.cn

2016-05-14

中國檢驗檢疫科學研究院基本科研業務費專項（2014JK027）；“十三五”國家重點研發計劃重點專項（2016YFD0401104）

任君安（1988—），女，博士研究生，研究方向為食品質量安全檢測與控制。E-mail：renja126@126.com

*通信作者：陳穎（1972—），女，研究員，博士，研究方向為食品質量安全與控制。E-mail：chenyingcaiq@163.com