五味子、黃芪混合多糖的提取及對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

孫 卉，苑榮爽，李 賀，張宇航，師繼超，陳建光，王春梅*

五味子、黃芪混合多糖的提取及對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用

孫 卉，苑榮爽，李 賀，張宇航，師繼超，陳建光，王春梅*

（北華大學藥學院，吉林 吉林 132013）

目的：優化五味子、黃芪混合多糖的提取工藝，并探討其對急性酒精所致小鼠肝損傷的保護作用。方法：采用正交試驗優化水提醇沉法提取五味子、黃芪混合多糖，將40只小鼠隨機分為空白對照組（CON）和空白對照＋五味子黃芪多糖治療組（CON＋SAP）、肝損傷模型組（MOD）、肝損傷模型＋五味子黃芪多糖治療組（MOD＋SAP）。SAP組小鼠每日灌胃給予五味子黃芪混合多糖100 mg/kg，CON組和MOD組給予同體積蒸餾水，連續30 d。末次給藥后1 h，MOD組和MOD＋SAP組小鼠灌胃給予50%酒精12 mL/kg，CON組和CON＋SAP組灌胃給予同體積蒸餾水。16 h后取血與肝臟，計算各組小鼠的肝臟指數，測定小鼠血清中谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）的水平，并測定肝組織中的甘油三酯（triglyceride，TG）、微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，蘇木精-伊紅染色法觀察肝臟病理學變化。結果：五味子、黃芪混合多糖最佳提取工藝為料液比1∶45（g/mL）、提取時間3 h、提取溫度100℃；與酒精性肝損傷模型組比較，五味子、黃芪混合多糖可降低小鼠肝臟指數（P＜0.05），降低血清中ALT和AST水平（P＜0.05），升高肝組織GSH含量（P＜0.01），并顯著降低肝組織MDA和TG含量（P＜0.05），改善肝臟病理學變化。結論：五味子、黃芪混合多糖對小鼠急性酒精性肝損傷具有一定的保護作用。

五味子；黃芪；多糖；急性酒精性肝損傷

長期飲酒容易引起酒精性肝病，嚴重危害身體健康[1]。常見的保肝藥有很多種類，中草藥中的五味子作為傳統保肝藥，具有降酶、促進肝再生、抗脂質過氧化、利膽、抗疲勞和增強免疫功能等作用[2-3]。目前的研究多集中在五味子木脂素類成分，而多糖是從五味子干燥成熟果實中提取出來的含有五味子總多糖的混合物[4]，在五味子中高達20%[5]。研究表明，五味子多糖藥理活性強、毒性低，在護肝降酶、提高免疫、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等方面具有顯著的作用和廣泛的應用前景[6-10]。黃芪的藥用歷史悠久，應用廣泛，多糖為其主要藥效成分，具有提高人體免疫功能、增強巨噬細胞活性、雙向調節血糖等作用[11]。有藥理研究表明，黃芪多糖具有明顯的減輕酒精性肝損傷作用[12]。本研究在中醫理論的指導下，通過五味子的滋腎斂陰，黃芪的補氣健脾，研究兩藥混合多糖的提取工藝以及對急性酒精性肝損傷的保護作用，為進一步的開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與實驗動物

五味子 吉林省集安五味子種植基地；中藥飲片黃芪（批號20140701-1） 河北祁新中藥顆粒飲片有限公司；谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT，批號20150724）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，A S T，批號2 0 1 5 0 6 2 5）、微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH，批號20150723）及甘油三酯（triglyceride，TG，批號20150728）4 種測定試劑盒南京建成生物工程研究所；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號 20150726） 上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

清潔級健康ICR小白鼠，雄性，體質量（20±2）g，由長春億斯實驗動物研究中心提供，許可證號為SCXK-（吉）2012-0005，合格證號為0007195。實驗室條件：室溫20～25℃，分籠飼養，飼料充足，飲水不限，適應環境5 d后用于實驗。

1.2 儀器與設備

JY92-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；KDM調溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司；Eppendorf AG小型臺式冷凍離心機、721B 型分光光度計上海第三分析儀器廠；Inf nite M200酶標儀 瑞士Tecan集團公司。

1.3 方法

1.3.1 五味子、黃芪混合多糖提取工藝

取五味子、黃芪藥材→粉碎→水提取→抽濾→濃縮→醇沉→干燥→稱質量得粗多糖→溶解→稀釋→苯酚-濃硫酸法測定含量→計算多糖質量濃度

1.3.2 單因素試驗

多糖提取工藝中涉及3 個關鍵條件即料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））、提取溫度（70、80、90、100℃）、提取時間（1、2、3、4、5 h），因此本研究針對這3 個條件分別做單因素試驗。

1.3.3 正交試驗設計

通過單因素試驗結果結合文獻資料，進行正交試驗設計，因素與水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平設計Table1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.4 多糖提取率及含量測定

五味子、黃芪樣品質量的比例為1∶3，多糖提取率計算如式（1）所示：

準確稱取5 mg無水葡萄糖稀釋到5 mL，再取0.5 mL稀釋到10 mL制成0.05 mg/mL的標準溶液，分別取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL補水至2 mL，加1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻，加入5 mL濃硫酸，充分振搖2 min，80℃水浴15 min，冷卻，488 nm波長處測定吸光度，以吸光度Y為縱坐標，質量濃度X（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=15.076x＋0.465（R2=0.998 8），以此曲線測定并計算所提粗多糖中的多糖含量。

1.3.5 動物實驗分組與處理

40只小鼠隨機分成4 組，分別為空白對照組（CON）、空白對照＋五味子黃芪多糖治療組（CON＋SAP）、酒精性肝損傷模型組（MOD）、肝損傷模型＋五味子黃芪多糖治療組（MOD＋SAP）。常規飼料喂養，自由飲水。CON＋SAP組和MOD＋SAP組小鼠每日灌胃給予五味子黃芪混合多糖100 mg/kg，CON組和MOD組每天灌胃給予同體積蒸餾水，連續30 d。末次給藥1 h后，MOD組和MOD＋SAP組小鼠分別灌胃給予50%酒精12 mL/kg，CON組和CON＋SAP組給予同體積蒸餾水，禁食，不禁水。16 h后，各組小鼠分別摘眼球取血，分離血清，分裝入EP管，－80℃凍存。斷髓處死小鼠，迅速剖腹取出肝臟，于冷的生理鹽水中洗凈血液，濾紙吸干，稱取肝臟質量，計算肝臟指數，如式（2）所示。剪下肝左葉置于10%甲醛溶液中固定，待做肝病理檢查。取肝組織加入9倍量的生理鹽水于冰水浴中制成組織勻漿，離心后取上清液，凍存。采用酶法測定血清中AST、ALT水平及肝組織中的GSH、TG、MDA含量，具體方法參照試劑盒說明書。

1.4 統計學分析

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對五味子、黃芪混合多糖提取率的影響

圖1 料液比對混合多糖提取率的影響Fig. 1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of SAP

分別選取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），提取溫度90℃，提取時間2 h進行浸提，抽濾，75%醇沉，干燥，稱質量，計算提取率，觀察料液比對浸提效果的影響。由圖1可知，五味子、黃芪混合多糖的提取率隨溶劑用量的增大而增加，當料液比在1∶40之后時，提取率下降，因此選取料液比為1∶40較為合適。

圖2 提取時間對混合多糖提取率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of SAP

2.1.2 提取時間對五味子和黃芪混合多糖提取率的影響分別選取時間1、2、3、4、5 h，提取溫度為90 ℃，料液比1∶40（g/mL），進行浸提，抽濾，75%醇沉，干燥，稱質量，計算提取率，觀察提取時間對浸提效果的影響。如圖2所示，隨著提取時間的延長，混合多糖提取率增加，4 h后增加趨于平緩，因此選擇最佳提取時間為4 h。

2.1.3 提取溫度對五味子和黃芪混合多糖提取率的影響

圖3 提取溫度對混合多糖提取率的影響Fig. 3 Effect of temperature on the yield of SAP

分別選取溫度70、80、90、100 ℃，料液比1∶40（g/mL），時間4 h，觀察溫度對浸提效果的影響。如圖3所示，隨著溫度的升高，多糖提取率增加，因此確定最佳提取溫度為100 ℃。

2.2 正交試驗結果

綜合單因素試驗結果，選擇提取溫度100 ℃、提取時間4 h與料液比1∶40（g/mL）3 個因素的較優水平，按L9（33）設計進行正交試驗，結果見表2和表3。

由表3可知，3 個因素對多糖含量的影響順序為提取溫度＞料液比＞提取時間，方差分析結果表明，料液比與提取溫度對提取的多糖含量有一定的影響，提取時間的影響不顯著。綜合考慮，選取的最佳工藝條件為A3B1C2，即料液比1∶45、提取時間3 h、提取溫度100 ℃。

表2 五味子、黃芪混合多糖提取正交試驗結果Table2 Orthogonal array design with experimental results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

2.3 五味子、黃芪混合多糖對小鼠急性酒精性肝損傷的影響

2.3.1 各組小鼠體質量和肝臟指數

表4 各組小鼠體質量和肝臟指數（x±s，n＝1100）Table4 Body weights and liver indexes of mice in different groups (x ± s,, n = 1100))

由表4可知，與CON組比較，MOD組小鼠體質量未見明顯變化，而肝臟質量和肝臟指數均明顯增大，差異顯著（P＜0.05），說明灌胃給予50%酒精后對小鼠肝組織造成了損傷，引起肝組織水腫。與MOD組相比，MOD＋SAP組小鼠的體質量無明顯差異，而肝臟質量及肝臟指數均有所下降。五味子黃芪多糖對正常小鼠體質量及肝臟質量均無明顯影響。

2.3.2 各組小鼠血清中ALT和AST水平

由表5可知，與CON組比較，模型組小鼠血清AST和 ALT水平均顯著增高（P＜0.05或P＜0.01），說明小鼠一次性灌胃50%酒精可引起小鼠肝細胞損傷。與MOD組比較，MOD＋SAP組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著下降（P＜0.05），提示其對酒精誘導的小鼠肝損傷具有一定的保護作用。而五味子黃芪多糖對正常小鼠血清中ALT和AST水平均無明顯影響。

表5 各組小鼠血清中ALT和AST水平（x±s，n＝1100）Table5 Activities of serum ALT and AST in different groups (x ± s,, n = 1100))

2.3.3 各組小鼠肝組織中GSH、MDA和TG的含量

表6 各組小鼠肝組織中GSH、MDA和TG的含量（x±s，n＝1100）Table6 Levels of GSH,TG and MDA in liver tissue in different groups (x ± s,, n = 1100))

由表6可知，與CON組比較，MOD組小鼠肝組織中GSH水平顯著降低（P＜0.05）、MDA和TG含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），表明酒精致肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力降低，氧化應激增強，肝組織中脂質含量增加。與MOD組比較，MOD＋SAP 組小鼠肝組織中GSH含量明顯升高（P＜0.01），MDA和TG含量均有顯著性降低（P＜0.05），提示小鼠肝臟的氧化應激狀況得以改善，脂類物質含量下降。而五味子黃芪多糖對正常小鼠肝組織中GSH、MDA和TG含量水平均無明顯影響。

2.3.4 各組小鼠肝組織病理形態變化

圖4 各組小鼠肝組織病理形態（蘇木精-伊紅染色，×200）Fig. 4 Liver pathomorphology in different groups (HE staining, × 200)

由光學顯微鏡結果顯示，CON組小鼠的肝細胞排列整齊，大小正常，細胞核大而圓，核質均勻分布，無水腫、變性、壞死、無炎癥細胞浸潤等現象（圖4A）。MOD組小鼠肝組織中肝索排列不規則，整個肝細胞胞漿疏松化，表明小鼠急性酒精性肝損傷模型建立成功（圖4C）。MOD＋SAP組小鼠肝細胞排列整齊，整個肝細胞胞漿疏松化明顯減輕，表明五味子黃芪多糖對小鼠酒精性肝損傷預防治療有效（圖4D）。

3 討 論

五味子為木蘭科植物五味子的果實，傳統中醫理論研究表明五味子具有益氣生津、補腎養心、收斂固澀之功效，實驗證明五味子能降酶護肝，可用于治療慢性肝炎[13]。黃芪具有補氣固表、利水消腫、脫毒生肌等功效，研究表明黃芪對中毒性肝損傷有保護作用，能增強機體的免疫功能，有助于肝炎恢復[14]。兩藥合用無配伍禁忌，且可同時發揮肝臟保護作用。

近年來，對植物多糖的研究越來越廣泛，其抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、增強免疫力等多種生物活性日益受到重視[15]。多糖是五味子和黃芪的主要活性成分，然而關于兩藥的多糖成分并未得到很好的研究開發和利用。本研究采用正交試驗考察料液比、提取時間、提取溫度對五味子、黃芪混合多糖含量的影響并優選出了提取工藝。經直觀分析和方差分析確定了五味子、黃芪混合多糖最佳提取工藝為料液比1∶45、提取時間3 h、提取溫度100℃。

為了探討五味子、黃芪混合多糖對肝損傷有保護作用，本實驗采用50%酒精一次性灌胃建立小鼠急性酒精性肝損傷模型[16]，因AST和ALT是肝細胞內的主要功能酶，是肝細胞損害的敏感性指標，故小鼠血中AST和ALT水平的高低可判斷其肝細胞損傷的程度[17]。本研究MOD組小鼠血清中AST和ALT水平均高于CON組，加之病理結果顯示MOD組小鼠整個肝細胞胞漿明顯疏松化，表明小鼠急性酒精性肝損傷動物模型制備成功，五味子、黃芪混合多糖可使肝損傷小鼠血清中AST和ALT水平明顯降低，肝細胞病理恢復正常，顯示出良好的肝損傷保護作用。

機體攝入大量酒精后，酒精經過酶類代謝時，產生大量的氧自由基，消耗很多還原性保護物質如GSH，引起脂質過氧化反應，導致肝損傷[18-19]，因此GSH含量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[20]，而脂質過氧化反應的最終代謝產物MDA[21]，可破壞細胞膜結構，導致細胞腫脹壞死[22]，MDA的含量可以反映過氧化損傷和細胞受損的程度[23-25]。本實驗中MOD組小鼠肝組織中MDA水平升高、GSH水平降低，而五味子、黃芪混合多糖治療顯著降低了肝組織MDA水平，升高了GSH水平，對抗自由基脂質過氧化反應，阻止肝細胞脂質過氧化，維持細胞質膜的正常結構，保護肝細胞免受損傷。酒精還可以使三羧循環和脂肪酸氧化受阻從而影響脂肪代謝，致使脂肪在肝細胞內沉積，大量蓄積可能導致病變。本實驗中MOD組小鼠肝組織中TG水平顯著升高，五味子、黃芪多糖治療使TG水平均顯著降低，改善了小鼠肝臟的脂肪代謝。

綜上所述，本研究通過正交試驗優選了五味子、黃芪混合多糖的提取工藝，并發現其對酒精誘導的急性肝損傷具有顯著的保護作用，其作用機制可能與抗自由基脂質過氧化反應及改善肝臟脂質代謝有關，這些結果為五味子、黃芪的進一步開發利用提供了理論依據。

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Extraction of Polysaccharides from Mixed Fructus Schisandrae and Radix Astragali and Their Protective Effects on Acute Liver Injury Induced by Alcohol in Mice

SUN Hui, YUAN Rongshuang, LI He, ZHANG Yuhang, SHI Jichao, CHEN Jianguang, WANG Chunmei*
(School of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013, China)

Objective: This study aimed to optimize the extraction of polysaccharides from mixed Fructus Schisandrae and Radix Astragali (SAP) and to examine their protective effects on alcohol-induced acute liver injury in mice. Methods: An orthogonal array design was applied to optimize SAP extraction by water extraction and alcohol precipitation. A total of 40 mice were randomly divided equally into normal control (CON) group, CON + SAP group, liver injury model (MOD) group and MOD + SAP group. The mice in the SAP-treated groups were intragastrically administered with 100 mg/kg SAP, and those in the CON and MOD groups were administered with an equal volume of distilled water for 30 days in the same way. Fifty percent ethanol (12 mL/kg) was orally given to the mice in the MOD and MOD + SAP groups at 1 hour after the last administration, and those in the CON and CON+SAP group were given an equal volume of distilled water intragastrically. Sixteen hours later, blood and liver samples were collected for the calculation of liver indexes of the mice in each group and the detection of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels in serum as well as the contents of reduced glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) and triglyceride (TG) in liver tissues. Hematoxylin-eosin staining (HE) was performed to observe pathological changes of liver tissues. Results: The optimum conditions for SAP extraction were determined as follows: solid-to-liquid ratio, 1:45; extraction time, 3 h; and temperature, 100 ℃. Compared with the alcohol-induced liver injury model, SAP significantly reduced the liver index in mice (P ＜ 0.05) and the levels of ALT and AST in serum (P ＜ 0.05), elevated the content of GSH (P ＜ 0.01), significantly reduced the contents of TG and MDA in livertissues (P ＜ 0.05), and improved the pathological changes of liver tissues. Conclusions: SAP could have a protective effect on alcohol-induced acute liver injury in mice.

Fructus Schisandrae; Radix Astragali; polysaccharide; alcohol-induced acute liver injury

10.7506/spkx1002-6630-201702043

R285.5

A

1002-6630（2017）02-0278-05

2016-03-24

吉林省科技廳醫藥產業推進計劃項目（20140311052YY）；吉林省科技廳產業技術創新戰略聯盟項目（20150309004YY）

孫卉（1989—），女，碩士研究生，研究方向為內分泌藥理學及藥物研發。E-mail：511047902@qq.com

*通信作者：王春梅（1974—），女，教授，博士，研究方向為內分泌藥理學及藥物研發。E-mail：wangcm74@126.com

孫卉, 苑榮爽, 李賀, 等. 五味子、黃芪混合多糖的提取及對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 278-282. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702043. http://www.spkx.net.cn

SUN Hui, YUAN Rongshuang, LI He, et al. Extraction of polysaccharides from mixed Fructus Schisandrae and Radix Astragali and their protective effects on acute liver injury induced by alcohol in mice[J]. Food Science, 2017, 38(2): 278-282. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702043. http://www.spkx.net.cn