分子印跡固相萃取技術對六堡茶中表兒茶素的分離特性

劉伯洋，李利軍，程 昊，黃文藝，馮 軍，孔紅星,*

分子印跡固相萃取技術對六堡茶中表兒茶素的分離特性

劉伯洋1，李利軍1，程 昊1，黃文藝1，馮 軍2，孔紅星1,*

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學醫學院，廣西 柳州 545005）

以表兒茶素為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，偶氮二異丁腈作為引發劑，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，通過原位聚合法制備分子印跡聚合物。首先考察不同模板分子、功能單體、交聯劑比例條件下表兒茶素分子印跡聚合物的特異性吸附能力。結果表明表兒茶素與丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯物質的量比為1∶6∶40時，分子印跡聚合物的吸附效果最佳，其模板分子回收率KMIPs為84.62%，特異性識別因子Q為4.55；然后利用掃描電子顯微鏡和紅外光譜技術對制備的印跡聚合材料進行表征；最后在毛細管電泳最優條件下對加載過固相萃取柱的過柱液與洗脫液進行檢測，建立分子印跡固相萃取-毛細管電泳聯用檢測表兒茶素的方法。實驗結果表明，分子印跡聚合物成功聚合，形貌良好且具有專一吸附特性。該方法適用于六堡茶中表兒茶素的檢測。

分子印跡；表兒茶素；固相萃取；毛細管電泳

六堡茶是中國千年名茶，屬黑茶類，因原產于廣西壯族自治區梧州市蒼梧縣六堡鄉而得名。表兒茶素是六堡茶葉中主要活性成分之一，約占兒茶素含量的40%～50%。研究表明，表兒茶素具有防治心血管疾病[1]、預防癌癥、抗氧化[2-3]等生物活性作用。尋找合適方法分離與測定六堡茶中表兒茶素，已經成為廣西本地茶資源推廣的重要考量依據。目前檢測表兒茶素的方法主要有高效液相色譜法[4-5]、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）法[6]等，但這些方法普遍存在預處理步驟復雜、檢測出樣品峰受雜質峰干擾嚴重或無法檢測出峰等缺點。

分子印跡固相萃取（molecularly imprinted solidphase extraction，MISPE）技術是近年來發展起來的一種新型SPE技術。通過化學方法合成分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs），利用印跡分子對實際樣品中某一特定分子具有特異性識別機理的特性，對待測物質進行選擇性分離。在MISPE過程中，模板分子會與MIPs中特定大小與形狀的空穴相結合，從而將目標分子保留在SPE柱內，然后將其洗脫下來，此時洗脫液中僅含有模板分子，從而達到對目標分子純化的效果。與傳統SPE法相比，MIPs對模板分子擁有較好的吸附性與選擇性，可以在復雜體系中選擇性吸附目標分子并將其更穩定的保存至柱內，只有使用較強洗脫效果的洗脫溶液才能將目標分子從MIPs上洗脫下來。這種選擇性吸附特性在天然活性物質分離領域內顯示出良好的應用前景[7-13]。本實驗采用原位聚合法制備表兒茶素MIPs，建立一種新的MISPE-CE聯用檢測方法以降低雜質峰干擾，從而更好的對六堡茶中表兒茶素進行分離與測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六堡茶 市購；表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯標準品、乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）（用前重結晶除阻聚劑）、偶氮二異丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN） 上海阿拉丁試劑有限公司；丙烯酰胺（azobisisobutyronitrile，AM），甲醇、乙醇、冰乙酸、正丙醇、1,4-丁二醇（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司；水為實驗室自制去離子雙蒸水。

1.2 儀器與設備

ACS2000型高效CE儀（正、負電源，電壓0～30 kV可調，未涂層熔融石英毛細管（50 cm×75 μm，有效長度36 cm）） 北京彩陸科學儀器有限公司；UV-2102PC型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；AR124CN電子天平 上海奧豪斯有限公司；RE-5203旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；DL-60D超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；傅里葉變換紅外分光光度計 上海珀金埃爾默儀器有限公司；HV 04-55場發射掃描電子顯微鏡 德國蔡司公司；ZFD-A5040A全自動新型鼓風干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 表兒茶素MIPs的制備

采用原位聚合法合成表兒茶素MIPs：以表兒茶素為模板分子，AM為功能單體，EGDMA為交聯劑，AIBN為引發劑，正丙醇與1,4-丁二醇混合溶液為致孔劑，分別按不同比例制備MIPs，如表1所示。

表1 制備表兒茶素MIPs的物料組成Table1 Chemicals used for making L-epicatechin MIPPss

以P3為例，稱取0.007 23 g（0.002 5 mmol）表兒茶素溶于正丙醇與1,4-丁二醇混合溶液中，加入0.010 8 g（0.15 mmol）AM，將混合溶液置于振蕩器中振蕩0.5 h，使AM與表兒茶素在溶劑中充分混合溶解，然后加入189 μL（1 mmol）EGDMA與1 mg（0.6 mmol）AIBN，將混合溶液放入超聲波清洗器中，在30 ℃條件下超聲脫氣20 min，然后用移液槍取80 μL混合溶液至200 μL移液槍槍頭中，充氮除氧10 min，密封槍頭兩端。將處理好的槍頭放入55 ℃恒溫水浴鍋中加熱24 h，加熱結束后取出槍頭得到圖1A所示的MISPE小柱，槍頭前端白色固體即為MIPs。將注射器與SPE小柱相連接如圖1B所示，用甲醇-冰乙酸（9∶1，V/V）混合溶液沖洗聚合物以去除MIPs中的模板分子，至洗脫液中檢測不到模板分子時停止洗脫。再用甲醇溶液對其進行二次洗脫，以除去殘留在萃取柱上的冰乙酸。最后將其放入鼓風干燥箱內60 ℃真空干燥24 h，將得到的聚合物槍頭放入干燥器中備用。

圖1 SPE柱效果圖Fig. 1 Solid phase extraction column

作為對照實驗，非印跡聚合物（non-molecularly imprinted polymers，NMIP）在無模板分子存在條件下利用相同條件制備。

1.3.2 MIPs與NMIP模板分子回收率實驗

采用SPE-CE法評價聚合物對模板分子的回收率。取制備好的P1、P2、P3、P4與NP1、NP2、NP3、NP4（NP為與聚合物P相對應的非印記聚合物）8 根SPE柱，進行實驗。將相同體積與物質的量的表兒茶素溶液加載至各組SPE柱上端，使用甲醇與冰乙酸對SPE柱進行洗脫，最終得到8 組洗脫液。將各組洗脫液在旋轉蒸發器中濃縮至干，然后用甲醇定容至初始體積，最后利用CE技術檢測8 組洗脫液中表兒茶素的物質的量。根據實驗前后溶液中表兒茶素物質的量的變化可計算聚合物模板分子回收率與特異性識別因子（Q）。

模板分子回收率按公式（1）計算：

式中：K為模板分子回收率/%；Cp為經過萃取柱后洗脫溶液中所含表兒茶素的物質的量/mol；Cc為表兒茶素在溶液中的物質的量/mol。

特異性識別因子（Q）按公式（2）計算：

式中：Q為特異性識別因子；KMIPs為MIPs對模板分子的回收率/%；KNMIP為NMIP對模板分子的回收率/%。

電泳條件：將相關文獻[14-16]與實際效果結合分析，得到CE檢測最佳條件。實驗室環境溫度25 ℃，重力進樣，進樣高度15 cm，進樣時間25 s，分離電壓－20 kV，于波長230 nm處直接檢測。背景緩沖液為30 mmol/L磷酸鹽的混合體系＋0.05 mmol/L CTAB＋12.5%乙腈混合溶液，pH值為10.0。

1.3.3 聚合物結構與形貌表征

利用傅里葉變換紅外分光光度計對表兒茶素MIPs結構進行表征。取1 mg待測物質與100 mg KBr混合壓片，在500～4 000 cm－1光譜范圍內分別對MIPs、NMIP與AM 3 種物質進行檢測。同時對槍頭狀的MISPE柱水平切面，經噴金處理后進行電子顯微鏡掃描，以考察柱內聚合物的形貌。

1.3.4 MIPs選擇性能實驗

配制甲醇為溶劑，濃度為0.1 mmol/L的表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯標準物質混合溶液，置于5 mL的離心管中，通過超聲除氣裝置將其混勻并脫氣。將混合溶液加載至SPE柱上端，收集過柱液，然后用甲醇淋洗萃取柱并收集淋洗液，再用甲醇-乙酸（9∶1，V/V）混合溶液對萃取柱進行洗脫，收集洗脫液。過柱液、淋洗液與洗脫液分別在旋轉蒸發器中濃縮至干，最后用甲醇定容至相同容積，再在電泳最優條件下分別對其進行檢測。

1.3.5 樣品處理

將六堡茶干茶葉放入中藥材粉碎機粉碎至粉末。取出適量茶葉粉末溶于乙醇溶劑，在85 ℃水浴條件下索氏提取4 h，實驗結束后將提取液倒入蒸發皿中，放入烘箱烘干備用。

2 結果與分析

2.1 聚合條件優化

圖2 表兒茶素分子印跡過程示意圖Fig. 2 Schematic illustration of molecularly imprinting of L-epicatechin

表兒茶素MISPE柱的特異性吸附性能與聚合物的組成、比例等條件密切相關。對模板分子而言，選擇合適功能單體是直接影響SPE柱吸附性能的關鍵。如圖2所示，由于表兒茶素分子中4 個羥基基團都可以形成氫鍵位點，而AM中含有的羰基基團，易與表兒茶素分子中的多個羥基基團以氫鍵相結合，因此選用表兒茶素作為模板分子，AM作為功能單體，并對模板分子、功能單體與交聯劑之間的配比進行優化與考察，以改善聚合物吸附及選擇性能。有文獻[17-25]報道，模板分子和功能單體比例一般為1∶4或1∶6，因為在此比例條件下模板分子和功能單體的結合量最大。為了考察模板分子、功能單體、交聯劑間配比對模板分子回收率的影響，對制備的8 種聚合物進行回收率分析，如表2所示。由于表兒茶素含有多個羥基，即單個分子能與功能單體作用的識別位點較多，所以需要功能單體的量也比較多，但是功能單體量太大則會增加聚合物非特異性吸附能力，降低SPE柱選擇吸附性能。表2實驗結果中，按P3比例制備的MIPs回收率最高，且特異性識別因子P3的值最大，說明聚合物特異性吸附作用力最強，非特異性吸附的影響最小。因此本實驗選用模板分子、功能單體與交聯劑物質的量比例為1∶6∶40作為MIPs制備最優條件。

表2 不同比例對聚合物模板分子回收率的影響Table2 Effect of template to functional monomer to cross-linking agent ratio on template recovery

2.2 MIPs形態結構表征

圖3 聚合物紅外光譜圖Fig. 3 IR spectra of molecularly imprinted and non-imprinted polymers

如圖3所示，AM特征峰在3 351.67、1 692.94 cm－1和1 612.68 cm－1處，這3 個吸收峰分別代表AM中N—H、C＝O和C＝C基團。由圖3a可知，MIPs的C＝O基團特征峰在1 730.31 cm－1處，說明該聚合物已通過EGDMA與AM成功聚合。NMIP的C＝O基團特征峰在1 632.93 cm－1處，比MIPs特征峰值低，這是因為MIPs中的C＝O基團受到了模板分子與功能單體之間氫健作用的影響。圖3a中3 451.95 cm－1處寬峰代表功能單體AM中N—H基團不對稱伸縮振動，而1 454.54 cm－1處的吸收峰則是不對稱酯中C—O基團。這些結果都可以表明MIPs已經成功制備。

圖4 MIPs掃描電鏡圖Fig. 4 Scanning electron micrographs of the molecularly imprinted polymer

在最優比例條件下所制備聚合物，通過掃描電鏡對聚合物的形貌進行表征，如圖4所示。聚合物呈顆粒狀疊加在一起，且擁有疏松多孔、分散性均一的特點，這種網狀結構使MIPs在SPE過程中具有較大比表面積與較低流動阻力，這些優點有助于增強其在樣品中特異性吸附性能。

2.3 MIPs選擇性吸附實驗

為近一步研究MIPs在SPE過程中選擇特性，本實驗選用濃度0.1 mmol/L表兒茶素與表兒茶素沒食子酸酯標準物質混合溶液，其結構式如圖5所示。對該混合溶液進行SPE實驗，如圖6所示。

圖5 表兒茶素（A）與表兒茶素沒食子酸酯（B）的化學結構式Fig. 5 Structures of L-epicatechin (A) and epicatechin-gallate (B)

圖6 MISPE過程中物混合溶液的CCEE圖Fig. 6 Capillary electropherograms of mixed solutions obtained during molecularly imprinted solid phase extraction

圖6 a表明，在最優電泳條件下混合溶液中表兒茶素與表兒茶素沒食子酸酯完全分離，峰形良好；在圖6b中，經過MISPE柱后過柱液僅檢測出小部分表兒茶素沒食子酸酯，這是因為表兒茶素與大部分表兒茶素沒食子酸酯已經吸附在MIPs上，沒有隨過柱液流出；SPE柱經甲醇淋洗后，淋洗液中僅能檢測到表兒茶素沒食子酸酯（圖6c）；采用更強洗脫能力的甲醇-乙酸（9∶1，V/V）溶液對SPE柱進行洗脫后，表兒茶素成功被洗脫下來如圖6d所示，模板分子在該洗脫溶劑條件下的回收率達到84.62%。比較混合溶液中2 種物質結構式（圖5）不難發現，表兒茶素沒食子酸酯空間體積遠大于表兒茶素，所以不容易進入以表兒茶素為模板分子合成的MIPs孔穴中。而由圖6b可知，部分表兒茶素沒食子酸酯吸附在MIPs上，這是因為SPE柱本身具有非特異性吸附作用，但這種弱吸附作用很容易被淋洗下來。因為表兒茶素是吸附在特定形貌與大小的印跡孔穴內，所以只有采用更強效果洗脫液才能將其洗脫下來。MIPs對不同分子具有不同的吸附能力，這種吸附特性使得表兒茶素分子在MISPE過程中被特異性吸附在SPE柱上，再經洗脫液流出，從而達到對復雜樣品中目標分子的純化作用。

2.4 實際樣品檢測

圖7 六堡茶樣品過柱前后CE圖Fig. 7 CE chromatogram of L-picatechin before and after MISPE

為了驗證表兒茶素MISPE柱在實際樣品中選擇特性，對六堡茶樣品進行CE檢測。配制甲醇作溶劑0.1 mmol/L樣品溶液在最優電泳條件下檢測，如圖7所示。由于六堡茶成分復雜，所以在圖7a中表兒茶素色譜峰周圍存在很多雜峰。而在過柱洗脫液中這些雜峰在很大程度上減弱甚至消失（圖7b）。這說明表兒茶素MISPE柱特異性吸附能力較強，有效分離出表兒茶素分子，從而較好避免實際樣品中雜質峰的干擾，且具備較高模板分子回收率。

3 結 論

本實驗采用原位聚合法在移液槍頭中制備表兒茶素MIPs。對不同組成比例MIPs與NMIP的模板分子回收率進行了對比分析。并對聚合物的結構與形貌進行表征，同時對多種溶質混合物與實際樣品進行SPE實驗，所得到的過柱液、淋洗液與洗脫液利用CE技術進行分析檢測。結果表明MISPE柱對表兒茶素具有專一吸附特性。本實驗制備方法操作簡單，使用原位聚合技術免去了傳統本體聚合技術中研磨聚合物與裝填萃取柱步驟，保證了聚合物形貌不被破壞，所制備的SPE柱可以多次重復使用，同時也為六堡茶中表兒茶素的檢測提供了一種新方法。

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Separation of L-Epicatechin in Liubao Tea by Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction

LIU Boyang1, LI Lijun1, CHENG Hao1, HUANG Wenyi1, FENG Jun2, KONG Hongxing1,*
(1. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources, College of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545006, China; 2. College of Medical, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545005, China)

Molecularly imprinted polymers (MIPs) were synthesized by in situ polymerization using L-epicatechin as the template molecule, acrylamide (AM) as the functional monomer, azobisisobutyronitrile (AIBN) as the initiator, and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as the cross-linking agent. Firstly, the specific adsorption capacity of L-epicatechin MIPs was evaluated as a function of the proportions of template molecule, functional monomer, and cross-linking agent. The results showed that when the molar ratio of L-epicatechin to acrylamide to ethylene glycol dimethacrylate was 1:6:40, MIPs exhibited the best adsorption capacity, with template molecule recovery (KMIPs) of 84.62% and specific recognition factor (Q) of 4.55. Scanning electron microscope (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) were used to characterize the MIPs. Finally, we used capillary electrophoresis to detect the effluent and the eluate under optimum conditions. As a result, a molecularly imprinted solid phase extraction-capillary electrophoresis (MISPE-CE) method for the determination of L-epicatechin was developed. The experimental results showed that molecularly imprinted polymers were successfully synthesized with good morphology and specific adsorption characteristics. This method is feasible for the analysis of L-epicatechin in Liubao tea.

molecular imprinting; L-epicatechin; solid phase extraction; capillary electrophoresis

10.7506/spkx1002-6630-201702027

O658

A

1002-6630（2017）02-0164-06

劉伯洋, 李利軍, 程昊, 等. 分子印跡固相萃取技術對六堡茶中表兒茶素的分離特性[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 164-169. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702027. http://www.spkx.net.cn

LIU Boyang, LI Lijun, CHENG Hao, et al. Separation of L-epicatechin in Liubao tea by molecularly imprinted solid phase extraction[J]. Food Science, 2017, 38(2): 164-169. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702027. http://www.spkx.net.cn

2016-03-30

廣西自然科學基金項目（2014GXNSFAA118402）；廣西高等學校高水平創新團隊及卓越學者計劃資助項目

劉伯洋（1991—），男，碩士研究生，研究方向為分子印跡技術開發與應用。E-mail：www.lby746129579@qq.com

*通信作者：孔紅星（1967—），男，研究員，碩士，研究方向為分析測試技術與糖資源綜合利用。E-mail：khx100@sina.com