酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與耐酸脅迫能力的相關性分析

陳其玲，任曉寧，王 玲，田 雨，趙美靜，宋巧智，劉樹文,2,3,*

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與耐酸脅迫能力的相關性分析

陳其玲1，任曉寧1，王 玲1，田 雨1，趙美靜1，宋巧智1，劉樹文1,2,3,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術中心，陜西 楊凌 712100；3.西北農林科技大學合陽葡萄試驗示范站，陜西 渭南 715300）

目的：β-葡萄糖苷酶是葡萄酒中結合態香氣物質釋放的關鍵酶，但其活性受諸多因素的影響。本研究旨在從酒酒球菌自身耐酸能力的視角去分析評估菌株糖苷酶活性，探索酸脅迫下不同耐酸表型酒酒球菌與其β-葡萄糖苷酶活性之間存在的相關性關系。方法：結合利用離子注入誘變與脅迫環境篩選的方式，獲得耐酸（pH 3.0）、酸敏（pH 9.0）突變酒酒球菌菌株，對其β-葡萄糖苷酶的活力進行測定，并篩選3 組酸脅迫下表型差異大的β-葡萄糖苷酶基因送樣測序。結果：耐酸突變酒酒球菌的β-葡萄糖苷酶酶活力是出發菌株的2～4 倍，是相應酸敏突變株的2～7 倍。測序結果顯示，除菌株a3的β-葡萄糖苷酶基因在108位（G置換成C）和1 232（A置換成T）位處發生了突變外，其余菌株β-葡萄糖苷酶的基因均未發生改變。結論：酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與菌株酸脅迫能力顯著相關（P＜0.05）。耐酸脅迫能力越強的菌株，β-葡萄糖苷酶活性越高。

酒酒球菌；離子注入誘變；酸脅迫；β-葡萄糖苷酶；相關性分析

葡萄酒的香氣是評價葡萄酒品質的重要指標之一。在麝香類的葡萄酒中，萜烯醇（尤其是單萜烯）是構成葡萄酒典型品種香氣的重要化合物[1-2]。但是，多數萜烯醇在葡萄酒中通常與糖以糖苷的形式結合，因而不能表現出其香氣特征[3]。在葡萄酒生產中，常采用酶促水解法分解風味前體物質以增強其香氣濃度及復雜性。通常情況下，糖苷類物質的水解需要多種糖苷酶共同參與完成，其中β-葡萄糖苷酶是結合態香氣物質釋放的關鍵酶[4-7]。

葡萄酒中的乳酸菌，尤其是酒酒球菌代謝產生的β-葡萄糖苷酶對葡萄酒香氣品質的提升效果尤為顯著[8-10]。但是，葡萄酒生境十分惡劣且復雜，高酸、高酒精、高二氧化硫、低糖環境等都會對糖苷酶活性產生影響[11-14]。目前的研究多是針對外界脅迫條件對酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的影響，鮮有對酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與菌株自身耐酸脅迫能力進行相關性研究。

因此，本研究通過離子注入誘變對3 株酒酒球菌進行離子注入，并于pH 3.0脅迫環境篩選耐酸突變株，于pH 9.0脅迫環境篩選酸敏突變株。通過比較這些耐酸差異菌株及其出發菌株的β-葡萄糖苷酶的β-葡萄糖苷酶活性，分析研究酒酒球菌的抗酸脅迫能力與其β-葡萄糖苷酶活性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 菌種

3 株酒酒球菌Oenococcus oeni SX-1a[15]、SX-1b[15]、CS-1b[16]由西北農林科技大學葡萄酒學院保藏。

1.2 培養基與試劑

酸性番茄汁培養基（acid tomato juice broth，ATB）（1 L）：番茄汁250 mL、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖10 g、MgSO40.2 g、MnSO40.05 g、鹽酸半胱氨酸0.5 g。固體培養基再加入瓊脂27 g，所有培養基再使用前均需在121 ℃條件下滅菌20 min，滅菌后用HCl和NaOH溶液調節培養基pH值。

對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG）、對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP） 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器與設備

AIR TECH超凈臺 中國蘇州安泰空氣技術有限公司；MJ-250B培養箱、H-4數顯恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；5417R1冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Nanodrop1000紫外分光光度計、Orion Star A111 pH計 美國Thermo Scientific公司；SS325滅菌鍋 日本Tomy公司；多功能復合離子注入機 成都同創材料表面新技術工程中心。

1.4 方法

1.4.1 菌株的誘變處理

菌體懸浮液的制備：挑取平板中的單個菌落（原始菌株）接入10 mL ATB液體培養基。以4%的接種量將活化種子液轉接于10 mL ATB液體培養基中進行二次活化。

離子注入：將制備好的菌體懸浮液0.1 mL均勻涂布于9 cm的無菌空白培養皿中央，置于超凈臺下，用無菌風吹干備用。將均勻涂布有菌體并吹干的培養皿置于離子注入小靶室內，注入離子N＋，能量為50 keV，注入靶室的真空度為10－3ions/cm2。

1.4.2 菌株的篩選

經離子注入后的樣品，用1 mL無菌水沖洗后，分別轉入到pH 3.0和pH 9.0的液體脅迫ATB培養基中，于26 ℃條件下培養，并在同樣脅迫環境中連續培養12 代后，于pH 4.8固體ATB培養基上通過劃線的方法進行兩次分離純化。最終獲得的單菌落于pH 4.8 ATB液體培養基中進行活化，將活化后的菌液再次接種到相應脅迫培養條件下（pH 3.0和pH 9.0），連續培養12 代，獲得性狀穩定的純化菌株。

1.4.3 酒酒球菌誘變菌株酸脅迫生長曲線繪制

將誘變菌株及其出發菌株于10 mL pH 4.8液體ATB培養基中26 ℃靜置培養，活化2 代后，取對數生長中期的菌體（A600nm＝1.0），并以4%接種量接種到pH 3.0液體ATB培養基中，繪制菌株酸脅迫生長曲線。

1.4.4 β-葡萄糖苷酶樣品的制備

按照1.4.3節中活化好的菌株，取對數生長末期（A600nm＝1.2）菌液各1 mL，10 000 r/min 離心10 min得菌體，將菌體用0.85% NaCl溶液洗滌2 次，最后使其懸浮于0.5 mL的0.85% NaCl溶液中。

1.4.5 β-葡萄糖苷酶活力測定

β-葡萄糖苷酶活力測定方法參照Barbagallo等[12]的方法略作修改。反應體系（3 mL）為：吸取0.5 mL檸檬酸磷酸緩沖液-pNPG混合液（pH 5.0，pNPG濃度5 mmol/L），加入1.4.4節制備的懸浮菌體0.5 mL，混合后于37 ℃條件下反應1 h，立即加入2 mL 1 000 mmol/L Na2CO3溶液終止反應。10 000 r/min離心15 min，轉移上清液至另一試管中。使用全波長酶標儀測定其在400 nm波長處的吸光度。對照樣品用0.85% NaCl緩沖液代替菌懸液制備，其他處理與樣品相同。標準曲線通過測定不同濃度（0～60 μmol/L）pNP溶液在400 nm波長處的吸光度獲得。菌體干質量按以下公式計算：

式中：A600nm為600 nm波長處菌懸液的吸光度；2.616 8為固定系數。

=δ[σ(α(x)),[σ(y),σ(z)]-σ([y,z])]-[σ(α(y)),[σ(x),σ(z)]-σ([x,z])]

β-葡萄糖苷酶活力定義為每克菌體（干質量）每分鐘生成pNP的物質的量/（μmol/（g·min））。

pNP標準曲線的繪制：在1～60 μmol/L濃度范圍內，回歸方程為y＝0.018 8x＋0.027 4，R2＝0.999 5，線性關系良好，滿足實驗需求。

1.4.6 β-糖苷酶基因聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

參照文獻[1 6]設計的引物，由生工生物（上海）股份有限公司合成：b g l-F：5’-GTGACTATGGTAGAGTTTCC-3’；bgl-R：5’-TCAAAACCCATTCCGTTCCCCA-3’。擴增產物用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠進行電泳分離（電壓80 V），電泳結束后將凝膠放在全自動凝膠成像分析系統中，拍照并分析。

對所有供試菌株β-葡萄糖苷酶進行PCR擴增，并篩選菌株酶活及抗酸表型差異較大的菌株，將其酶切產物送生工生物工程（上海）有限公司純化并測序。然后，利用生物信息學分析軟件MAGA 6.0將所有測序糖苷酶基因序列進行核苷酸同源性比對，并提交到GenBank上。以確保酶活力的差異并不是由于誘變造成的糖苷酶基因突變所引起。

1.5 數據處理

酶活力為3 次測定的平均值。實驗結果采用SPSS 20.0分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 誘變菌株

離子注入誘變獲得的誘變菌株、相應的誘變劑量和后期篩選條件見表1。

表1 誘變菌株Table1 Information about O. ooeennii mutants

離子注入誘變育種具有高突變率、突變譜廣、性狀穩定等特點[17]。經離子注入菌株轉入pH 3.0低酸脅迫環境下培養，分離純化后共獲得5 株突變菌，其中SX-1a突變菌1 株、SX-1b突變株2 株、CS-1b突變株2 株；pH 9.0堿脅迫條件下分離純化后獲得突變株5 株，其中SX-1a 2 株、SX-1b 1 株、CS-1b 2株，所有純化后的突變菌株都再次經過繼代培養（不少于12代），確保獲得的突變株具有穩定的耐酸/酸敏性狀。其中，出發菌株SX-1a、SX-1b、CS-1b在pH 3.0以及pH 9.0脅迫環境中連續培養3～5 代后，菌株基本已經喪失活性。

2.2 酸脅迫環境下菌體的生長曲線

圖1 酒酒球菌SX-1a（a）、SX-1b（b）、CS-1b（c）及其誘變株在酸脅迫環境中的生長曲線（pH 3.0 ATB培養基）Fig. 1 Growth curves of O. oeni SX-1a (a), SX-1b (b), CS-1b (c) and corresponding mutants cultured in ATB medium (pH 3.0)

由圖1可知，pH 3.0低酸性脅迫環境中，篩選獲得的突變株b1、a3、c1和c2在穩定期的生物量（即A600nm值）高于對應的出發菌株SX-1b、SX-1a、CS-1b。而于pH 9.0堿性脅迫環境中篩選獲得的突變株b2、a1-1、a1-2、c2-1、c2-2，在穩定期的生物量則低于對應的出發菌株。實驗結果顯示，篩選自pH 3.0環境的突變株（即耐酸突變株）耐酸脅迫能力高于出發菌株，而篩選自pH 9.0環境的突變株（即酸敏突變株）耐酸脅迫能力低于出發菌株。

葡萄酒的高酸環境是限制乳酸菌活性的重要因素之一[18-19]。酒酒球菌能否耐受葡萄酒酒體的高酸環境，直接決定著菌體能否在酒體環境中生長繁殖、啟動并主導完成蘋果酸-乳酸發酵、代謝產生糖苷酶酶解糖苷等[20-21]。在某些冷涼產區，蘋果酸-乳酸發酵強葡萄酒的pH值較低，約為2.5～3.0。Tourdot-Maréchal等[22]研究顯示，當

酒酒球菌暴露于pH 3.2脅迫環境時，菌株生長受到嚴重的抑制。本實驗篩選獲得的耐酸突變株b1、a3、c1和c2在pH 3.0低酸環境中，累積最大生物量（穩定期A600nm值）與出發菌株在最適環境（pH 4.8）中的能夠達到的最大生物量相近（SX-1b、SX-1a、CS-1b在pH 4.8環境下，穩定期A600nm值分別是1.538、1.828和1.611）。結果表明，耐酸突變菌株在酸脅迫環境中表現出很強的生長能力。

2.3 不同菌株β-葡萄糖苷酶活力的比較

表2 酒酒球菌CS-1b及其誘變菌株β-葡萄糖苷酶活力Table2 β-Glycosidase activities ofO. ooeennii CS-1b and the corresponding mutants

以pNPG為反應底物，于37 ℃條件下反應1 h，測定13 株酒酒球菌中β-葡萄糖苷酶活力。由表2可知，耐酸突變株c1、c2的β-葡萄糖苷酶活力高于出發菌株，其中突變株c1的酶活力最高，是出發菌株酶活力的1.69 倍。而酸敏突變株c2-1、c2-2的β-糖苷酶活力低于出發菌株CS-1b，其中c2-1的酶活力最低，僅是出發菌株酶活力的45.25%，是耐酸突變菌株c1酶活力的26.85%。

表3 酒酒球菌SX-1b及其誘變菌株β-葡萄糖苷酶活力Table3 β-Glycosidase activitiesof O. oeennii SX-1b and the corresponding mutants

由表3可知，耐酸突變株b1、b3的β-葡萄糖苷酶活力高于出發菌株SX-1b，其中突變株b1的酶活力是出發菌株酶活的4.47 倍，是突變株b3酶活力的1.95 倍，是突變株b2酶活力的7.50 倍。突變株b2的β-糖苷酶活力最低，僅是出發菌株酶活力的59.35%。

表4 酒酒球菌SX-1a及其誘變菌株β-葡萄糖苷酶活力Table4 β-Glycosidase activity ofO. oeennii SX-1a and the corresponding mutants

由表4可知，突變株a3的β-葡萄糖苷酶活力最高，是出發菌株SX-1a酶活力的2.54 倍，是突變株a1-1酶活力的2.82 倍，是突變株a1-2酶活力的2.5 倍。結果顯示，酸脅迫能力強的菌株（如a3、b1、

c1），其β-葡萄糖苷酶活力遠高于酸敏突變株。這可能是因為相較于酸敏突變株，耐酸突變株在低酸環境中具有較強的維持胞內pH值平衡的能力，而細胞內酸堿穩定的狀態能夠確保參與菌株各個代謝系統的酶活性[23-25]，使各代謝有條不紊的進行，從而維持了菌株的正常生長繁殖。且當O. oeni各項生理機能維持正常水平時，其參與的蘋果酸代謝、氨基酸代謝等反過來幫助調控細胞內酸堿平衡、維持細胞內的pH值平衡，更有利于菌體在高酸的環境下生長代謝[15,19]。由此也可以證實，當將酸敏菌株暴露于酸性環境中，其胞內的酸堿平衡瞬間被打破，且其調節細胞內生境pH值平衡的能力差，因而得不到很好的修復，使得胞內參與各個代謝通路的酶活性受到抑制，直接導致胞內的各個代謝通路停滯，細胞更加不能正常代謝生長[22]，相應的生產β-葡萄糖苷酶效率也不高。

2.4 β-葡萄糖苷酶基因檢測

2.4.1 β-葡萄糖苷酶目的基因PCR擴增

圖2 目的基因PCR擴增產物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of PCR-amplified products

13 株菌株β-葡萄糖苷酶基因的PCR擴增產物電泳圖如圖2所示。所有菌株都得到了1 400 bp左右大小的擴增產物。

2.4.2 β-葡萄糖苷酶基因序列分析

為排除誘變可能引發菌株β-葡萄糖苷酶基因的改變，從而導致其β-葡萄糖苷酶活性發生變化可能性。篩選3 組耐酸脅迫能力差異大且酶活性差異大的菌株（耐酸突變株a3、c1、b1，以及對應的酸敏突變株a1-1、c2-1、b2，出發菌株SX-1a、SX-1b），對其β-葡萄糖苷酶基因進行分析。測序結果提交GenBank核酸數據庫，菌株SX-1a、SX-1b、a1-1、a3、c2-1、c1、b1、b2的β-葡萄糖苷酶基因訪問號依次為KU594295、KU594296、KU594297、KU594298、KU594299、KU594300、KU594301、KU594302。BLAST比對結果顯示，8 株測定序列與GenBank中已發表的酒酒球菌β-糖苷酶基因序列（GenBank：AY489108.1）同源性高達99%。

此外，除菌株a3的糖苷酶基因序列在108位（G置換成C）和1 232位（A置換成T）堿基處發生了改變，翻譯成蛋白質序列的比對結果顯示，a3菌株對應的蛋白質序列僅在411位處發生了改變，由酪氨酸（Y）突變成了苯丙氨酸（F）。其余7 株菌的β-葡萄糖苷酶基因序列一致。實驗數據表明，β-葡萄糖苷酶基因不是造成耐酸突變株與酸敏突變株之間酶活性差異的原因。

2.5 相關性分析

表5 酒酒球菌pH 3.0累積生物量和β-葡萄糖苷酶活性的相關性分析Table5 Correlation analysis between O. oeennii maximum biomass at pH 3.0 anndd β-glycosidase activviittyy

分別對酒酒球菌SX-1a及其突變株（第1組）、SX-1b及其突變株（第2組）、CS-1b及其突變株（第3組），pH 3.0累積最大生物量（穩定期的A600nm）與β-葡萄糖苷酶平均酶活進行相關性分析。從表5可知，酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與菌株自身耐酸脅迫能力顯著相關。

3 討 論

為了挖掘酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活力與其耐酸脅迫能力之間的關聯性。本實驗通過結合利用離子注入誘變和脅迫培養的方式，獲得了耐酸性狀能夠穩定遺傳、pH 3.0低酸脅迫下生長能力具有明顯差異的酒酒球菌耐酸和酸敏突變菌株，最大限度地避免菌株遺傳背景的差異，為酶活力與耐酸脅迫能力關聯性提供可靠的佐證。實驗結果最終證實，酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活力與其耐酸脅迫能力相關。且實驗篩選獲得的耐酸、酸敏酒酒球菌為研究酒酒球菌酸脅迫調控基因提供了優良菌株資源。β-葡萄糖苷酶活力數據以及糖苷酶基因測序結果顯示，耐酸突變株的β-葡萄糖苷酶活力遠高于酸敏突變株，可能是參與調控細胞酸脅迫的某些生理機制也參與調控了菌株的β-葡萄糖苷酶基因的表達有關，并且離子注入使得耐酸突變株中，更多同時參與調控耐酸脅迫機制和酶活力表達機制的基因被激活，表現出耐酸突變株更強耐酸能力、酶活力的提升，不過詳細的機理還需進一步的研究。

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的活性還受到酒體其他因素的影響，如酒精、二氧化硫、糖含量等。因此，理論上認為酒酒球菌耐酒精、二氧化硫等脅迫環境的能力與酶活力之間也存在著相關性。本實驗的方法可為其他相關性研究提供參考。

本實驗中篩選獲得的耐酸突變酒酒球菌，能夠在酸性環境下保持旺盛的活力和較高的β-葡萄酒苷酶的活性，可以適應葡萄酒酒體的低酸環境，為低酸葡萄原料接種啟動蘋果酸-乳酸發酵提供了優秀菌種資源。但是，耐酸突變酒酒球菌菌株否能夠順利啟動蘋果酸-乳酸發酵，并且實現可靠且安全的高產、穩產β-葡萄糖苷酶，提高葡萄酒感官質量，這仍需要進一步的研究。

[1] MAICAS S, MATEO J J. Hydrolysis of terpenyl glycosides in grape juice and other fruit juices: a review[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 67(3): 322-335. DOI:10.1007/s00253-004-1806-0.

[2] ZIETEMA A J J, de KLERK D, van RENSBURG P. Coexpression of alpha-L-arabinofuranosidase and beta-glucosidase in Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Yeast Research, 2011, 11(1): 88-103. DOI:10.1111/j.1567-1364.2010.00694.x.

[3] MATEO J J, JIMéNEZ M. Monoterpenes in grape juice and wines[J]. Journal of Chromatography A, 2000, 881(1/2): 557-567. DOI:10.1016/ S0021-9673(99)01342-4.

[4] GUEGUEN Y, CHEMARDIN P, JANBON G, et al. A very eff cient beta-glucosidase catalyst for the hydrolysis of flavor precursors of wines and fruit juices[J]. Journal of Agricultural and Food Ch emistry, 1996, 44(8): 2336-2340. DOI:10.1021/jf950360j.

[5] GUEGUEN Y, CHEMARDIN P, PIEN S, et al. Enhancement of aromatic quality of Muscat wine by the use of immobilized betaglucosidase[J]. Journal of Biotechnology, 1997, 55(3): 151-156. DOI:10.1016/S0168-1656(97)00069-2.

[6] PARK S K, NOBLE A C. Monoterpenes and monoterpene glycosides in wine aromas[J]. ACS Symposium Series, 1993, 536: 98-109. DOI:10.1021/bk-1993-0536.ch 006.

[7] SARRY J E, GüNATA Z. Plant and microbial glycoside hydrolases: volatile release from glycosidic aroma precursors[J]. Food Chemistry, 2004, 87(4): 509-521. DOI:10.1016/j.foodchem.2004.01.003.

[8] MESAS J M, RODRíGUEZ M C, ALEGRE M T. Basic characterization and partial purification of beta-glucosidase from cell-free extracts of Oenococcus oeni ST81[J]. Letters in Applied Microbiology, 2012, 55(3): 247-255. DOI:10.1111/j.1472-765X.2012.03285.x.Epub 2012 Jul 24.

[9] MICHLMAYR H, SCHUMANN C, WURBS P, et al. A betaglucosidase from Oenococcus oeni ATCC BAA-1163 with potential for aroma release in wine: cloning and expression in E. coli[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, 26(7): 1281-1289. DOI:10.1007/s11274-009-0299-5.

[10] MTSHALI P S, DIVOL B, van RENSBURG P, et al. Genetic screening of wine-related enzymes in Lactobacillus species isolated from South African wines[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 108(4): 1389-1397. DOI:10.1111/j.1365-2672.2009.04535.x.Epub2009Aug 22.

[11] UGLIANO M, GENOVESE A, MOIO L. Hydrolysis of wine aroma precursors during malolactic fermentation with four commercial starter cultures of Oenococcus oeni[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(17): 5073-5078. DOI:10.1021/jf0342019.

[12] BARBAGALLO R N, SPAGNA G, PALMERI R, et al. Assessment of β-glucosidase activity in selected wild strains of Oenococcus oeni for malolactic fermentation[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 34(3/4): 292-296. DOI:10.1016/j.enzmictec.2003.11.013.

[13] MCMAHON H, ZOECKLEIN B W, FUGELSANG K, et al. Quantification of glycosidase activities in selected yeasts and lactic acid bacteria[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1999, 23(3): 198-203. DOI:10.1038/sj.jim.2900720.

[14] SPANO G, RINALDI A, UGLIANO M, et al. A beta-glucosidase gene isolated from wine Lactobacillus plantarum is regulated by abiotic stresses[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 98(4): 855-861.

[15] JIN G, WANG H, ZHANG C H, et al. Characterization and amino acid metabolism performances of indigenous Oenococcus oeni isolated from Chinese wines[J]. European Food Research and Technology, 2014, 238(4): 597-605. DOI:10.1007/s00217-013-2112-9.

[16] 楊芮, 呂珍, 文彥, 等. 酒類酒球菌中β-葡萄糖苷酶性質研究[J]. 食品科學, 2013, 34(23): 206-211. DOI:10.7506/ spkxl1002-6630-201323043.

[17] 孟佑婷, 劉桂君, 楊素玲, 等. 離子注入誘變改良農業微生物的研究進展及應用前景[J]. 安徽農業科學, 2012, 40(19): 9992-9993; 10014. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2012.19.009.

[18] 李亞輝, 董梅, 崔禾苗, 等. 酒酒球菌SD-2a的β-D-葡萄糖苷酶活性研究[J]. 食品科技, 2013, 38(8): 48-52.

[19] PIMENTEL M S, SILVA M H, CORTES I, et al. Growth and metabolism of sugar and acids of Leuconostoc oenos under different conditions of temperature and pH[J]. Journal of Applied Microbiology, 1994, 76(1): 42-48. DOI:10.1111/j.1365-2672.1994.tb04413.x.

[20] VERSARI A, PARPINELLO G P, CATTANEO M. Leuconostoc oenos and malolactic fermentation in wine: a review[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1999, 23(6): 447-455. DOI:10.1038/ sj.jim.2900733.

[21] CARRASCOSA A V, MU?OZ R, GONZALEZ R, et al. Molecular wine microbiology[M]. San Diego: Academic Press, 2011: 191-226. DOI:10.1016/B978-0-12-375021-1.10018-9.

[22] TOURDOT-MARéCHAL R, FORTIER L C, GUZZO J, et al. Acid sensitivity of neomycin-resistant mutants of Oenococcus oeni: a relationship between reduction of ATPase activity and lack of malolactic activity[J]. FEMS Microbiology Letters, 1999, 178(2): 319-326. DOI:10.1016/S0378-1097(99)00377-8.

[23] GUZZO J, COUCHENEY F, PIERRE F, et al. Acidophilic behaviour of the malolactic bacterium Oenococcus oeni[J]. Sciences des Aliments, 2002, 22(1/2): 107-111. DOI:10.3166/sda.22.107-111.

[24] GUZZO J, DELMAS F, PIERRE F, et al. A small heat shock protein from Leuconostoc oenos induced by multiple stresses and during stationary growth phase[J]. Letters in Applied Microbiology, 1997, 24(5): 393-396. DOI:10.1046/j.1472-765X.1997.00042.x.

[25] GUZZO J, JOBIN M P, DELMAS F, et al. Regulation of stress response in Oenococcus oeni as a function of environmental changes and growth phase[J]. International Journal of Food Microbiology, 2000, 55(1/2/3): 27-31. DOI:10.1016/S0168-1605(00)00209-9.

Correlation between β-Glycosidase Activity and Acid Stress Tolerance in Oenococcus oeni

CHEN Qiling1, REN Xiaoning1, WANG Ling1, TIAN Yu1, ZHAO Meijing1, SONG Qiaozhi1, LIU Shuwen1,2,3,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China; 3. Heyang Experimental Demonstration Station, Northwest A&F University, Yangling 715300, China)

Objective: β-Glycosidase plays a crucial role in the hydrolysis of aglycones and subsequent release of grapederived aroma compounds in wine. However, β-glycosidase activity is inf uenced by many factors. This study was designed taking into account the acid tolerance of Oenococcus oeni to assess and correlate their glucosidase activities with acid stress tolerance. Methods: The cells of O. oeni were implanted with N＋ion to obtain acid-tolerant (pH 3.0) and acid-sensitive (pH 9.0) mutants. Besides, β-glycosidase activities of all the tested strains were determined. Three groups of variant O. oeni were selected and their β-glycosidase genes were sequenced. Results: The acid-tolerant mutants harbored a signif cantly increased β-glucosidase activity that was 2-4 times higher than that of the original strains, and 2-7 times higher than that of the corresponding acid-sensitive mutants. Sequencing results of eight representative amplicons indicated that all the mutants and their parental strains were identical to each other, except a3 mutant, which formed two base transversions at 108 gene locus (G→C) and at 1 232 locus (A→T). Conclusion: Correlation analysis indicated that O. oeni β-glycosidase activity was signif cantly positively related to acid stress resistance (P ＜ 0.05).

Oenococcus oeni; ion implantation; acid tolerance; β-glucosidase; correlation analysis

10.7506/spkx1002-6630-201702019

Q815

A

1002-6630（2017）02-0115-06

陳其玲, 任曉寧, 王玲, 等. 酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性與耐酸脅迫能力的相關性分析[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 115-120. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702019. http://www.spkx.net.cn

CHEN Qiling, REN Xiaoning, WANG Ling, et al. Correlation between β-glycosidase activity and acid stress tolerance in Oenococcus oeni[J]. Food Science, 2017, 38(2): 115-120. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702019. http://www.spkx.net.cn

2016-03-11

陳其玲（1991—），女，碩士研究生，研究方向為釀酒微生物。E-mail：fjgcql@sina.com

*通信作者：劉樹文（1965—），男，教授，博士，研究方向為釀酒微生物。E-mail：liushuwen@nwsuaf.edu.cn