重組大腸桿菌合成光學純L-苯基乳酸

朱益波，魯如彬，程 俊，王 穎,2，齊 斌，王立梅,*

重組大腸桿菌合成光學純L-苯基乳酸

朱益波1，魯如彬1，程 俊1，王 穎1,2，齊 斌1，王立梅1,*

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 蘇州 215500；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

以巨大芽孢桿菌Z2013513基因組DNA為模板，分別PCR擴增得到L-乳酸脫氫酶基因（ldhL）和葡萄糖脫氫酶基因（gdh），將gdh與ldhL分別連接至表達載體pETDuet，獲得共表達質粒pETDuet-ldhL-gdh。經轉化和驗證獲得重組菌大腸桿菌BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和比酶活力分析表明重組蛋白L-乳酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶均成功表達且具有酶活力。在37 ℃、200 r/min條件下，經60 min反應，催化底物苯丙酮酸合成24.26 mmol/L L-苯基乳酸。產物L-苯基乳酸光學純度（＞99%），底物摩爾轉化率（59.55%），結果表明此重組體系可用于高效合成高光學純L-苯基乳酸。

L-2-羥基-3-苯基丙酸；巨大芽孢桿菌Z2013513；L-乳酸脫氫酶；葡萄糖脫氫酶；NADH再生；全細胞催化

L-苯基乳酸（L-phenyllactic acid，L-PLA），即L-2-羥基-3-苯基丙酸[1]，是PLA的一種手性異構體，與手性對映異構體D-PLA天然共存于蜂蜜和乳酸菌發酵產物[2]中。L-PLA因其多種特殊生物活性，在醫藥、精細化工和生物合成等領域應用廣泛，特別是作為一些抗高血壓、抗艾滋病病毒等重要合成藥物的手性中間體[3-4]。PLA用作動物飼料添加劑能提高動物免疫能力，是抗生素的有效替代物[5]。新型功能聚合物材料聚L-PLA[6]是非常具有應用潛力的可生物降解材料[7]，有助于減少不可再生能源消耗和溫室氣體排放。近二十年來，國內外研究表明，L-PLA對多種食源性致病菌具有抑制作用[1,8-9]，其穩定性高，同時是苯丙氨酸代謝產物[10]，對人和動物細胞無毒害作用[11]，在食品防腐方面也具有很大發展潛力[12-13]。而高光學純度的L-PLA的生產成本較高、產量較低[14]，是其廣泛應用的限制因素。

圖1 輔因子再生偶聯體系催化PPAA合成L-PLLAA示意圖Fig. 1 Schematic illustration of L-PLA production from PPA with NADH regeneration system

L-乳酸脫氫酶（L-lactate dehydrogenase，L-LDH）是微生物立體特異性催化合成L-PLA的關鍵酶[15-16]，此反應需要輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）[17]。由于微生物細胞內自身L-LDH的表達受到嚴格代謝調控[18]，并且輔因子NADH不足也是L-PLA合成的關鍵限制因素（圖1）。葡萄糖/葡萄糖脫氫酶（g l u c o s e dehydrogenase，GDH）系統[19]因催化效率高、反應不可逆、底物葡萄糖價格低廉而適用于微生物體內NADH再生而應用廣泛。光學純化合物制備方法主要有化學合成法、微生物合成法[20-21]和酶催化法[22-23]。其中微生物全細胞轉化法[24]因其反應條件溫和、操作安全、能耗低、底物轉化率高和光學特異性選擇性高等特點[25-26]而受到廣泛關注。因此，利用基因工程手段高效共表達L-LDH和GDH是促進L-PLA持續合成的有效途徑。

本研究構建一株共表達L-LDH和GDH的基因工程菌大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）/pETDuetldhL-gdh，此輔因子再生偶聯體系[27]具有全細胞轉化還原苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA）生產高光學純度L-PLA的能力，為進一步提高微生物合成L-PLA的生產強度、光學純度和底物轉化率提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

pMD19-T簡易載體購自寶生物工程（大連）有限公司；E. coli JM109、E. coli BL21（DE3）、pETDuet-1均為蘇州市食品生物技術重點實驗室保藏。

1.1.2 培養基

Luria-Bertani（LB）培養基：酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。根據需要，在培養基中添加100 μg/mL氨芐青霉素。

1.1.3 試劑

L-PLA、D-PLA、PPA 國藥集團化學試劑有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨 英國Oxoid公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（i s o p r o p y l-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、DNA聚合酶、DNA Marker、NADH、氨芐青霉素、質粒小量提取及DNA片段膠純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；T4 DNA連接酶、限制性內切酶 寶生物工程（大連）有限公司；B-PER細菌總蛋白提取試劑 美國Thermo公司；所有實驗試劑如果無特殊說明均為分析純。

1.2 儀器與設備

C1000 Touch基因擴增儀、DYCP-31BN瓊脂糖水平電泳系統、Protein Ⅱ垂直電泳系統、Geltol EZ凝膠成像系統、X-Mark微孔板分光光度計 美國Bio-Rad公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；SC100水浴控制器 美國Thermo公司；CTO-20AC高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀日本島津公司；HZQ-F280恒溫振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分子克隆

表1 ldhL和gdh基因引物Table1 PCR primers for llddhhLL aanndd ggddhh geenneess

基因組DNA和質粒DNA提取純化、DNA酶切、連接和轉化、感受態細胞制備均參照產品說明書。根據NCBI中已知的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）WSH-002 ldhL（NCBI參考序列：NC_017138.1）和gdh（GenBank：CP003017.1）基因序列分別設計特異性引物（表1）。

以B. megaterium Z2013513（CCTCC：M2013244）基因組DNA為模板，對ldhL和gdh基因分別進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR反應體系（50 μL）：10×PCR Buffer （含Mg2+） 5 μL、dNTP（10 mmol/L） 1 μL、Taq Plus DNA聚合酶（5 U/μL） 1 μL、基因組DNA模板2 μL、上下游引物（10 pmol）各2 μL、滅菌超純水37 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，55 ℃ （ldhL）或58 ℃ （gdh）退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環25 次，最后72 ℃終延伸10 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物大小是否正確，進行膠回收。目的基因片段與pMD19-T簡易載體用T4 DNA連接酶16 ℃條件下連接過夜，熱擊轉化至感受態細胞E. coli JM109中，復蘇1 h后涂平板，根據藍白斑篩選陽性克隆。通過雙酶切鑒定后，獲得陽性克隆子E. coli JM109/pMD19-T-ldhL和E. coli JM109/pMD19-T-gdh，DNA測序驗證。引物合成和DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.2 重組表達質粒pETDuet-ldhL-gdh的構建

將克隆載體pMD19-T-gdh經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切產物進行瓊脂糖核酸電泳，膠回收獲得目的基因gdh，連接至經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的表達質粒pETDuet-1雙克隆位點MCS2中，轉化到E. coli BL21（DE3）感受態細胞中，經質粒酶切和菌落PCR驗證，獲得重組大腸桿菌BL21（DE3）/pETDuet-gdh。然后將克隆載體pMD19-T-ldhL經BamHⅠ和PstⅠ雙酶切產物進行核酸電泳膠回收，獲得目的基因ldhL，連接至經BamHⅠ和PstⅠ雙酶切的表達質粒pETDuet-1和pETDuet-gdh雙克隆位點MCS1中，轉化到E. coli BL21（DE3）感受態細胞中，經質粒酶切和菌落PCR驗證，獲得E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh。

1.3.3 目的基因的誘導表達

挑取E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL單菌落分別接種于10 mL LB液體培養基（含100 μg/mL氨芐青霉素），37 ℃、200 r/min條件下培養過夜。按體積分數1%的接種量轉接入100 mL LB培養基（含100 μg/mL氨芐青霉素）中，37 ℃、200 r/min條件下培養至OD600nm為0.4～1.0，添加誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，25 ℃條件下低溫誘導表達6 h。原始菌E. coli BL21（DE3）經無抗生素培養基過夜培養后同樣進行低溫誘導處理。以上3 種誘導后菌液離心、洗滌、稀釋處理參照文獻[28]，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析重組蛋白共表達情況[28]。

1.3.4 L-LDH和GDH比酶活力測定

取誘導后的菌液E. coli BL21（DE3）、E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuetldhL-gdh進行離心洗滌后稀釋至OD600nm為1，取1 mL稀釋液離心收集菌體，加入500 μL B-PER裂解液，充分混勻后30 ℃振蕩10 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，取適量上清液進行L-LDH和GDH比活力測定[29]。

由于NADH在340 nm波長處有最大吸收峰，通過反應中光吸收峰值的改變定量測定酶活力。L-LDH酶活力測定參照文獻[28]。GDH酶活力測定體系（3 mL）：適量粗酶液5～30 μL，100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 8.0），2 mmol/L NAD＋和100 mmol/L葡萄糖。在30 ℃、pH 7.0條件下，每分鐘消耗或生成1 μmol/L NADH所需的酶量為1 個比酶活力單位（U/mL）。蛋白質濃度測定采用Bradford法。比酶活力定義為：每毫克酶蛋白所含的酶活力單位（U/mg）。

1.3.5 重組E. coli全細胞轉化PPA合成L-PLA

E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL經菌體活化和誘導表達后，分別離心收集菌體并用磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）洗滌2 次，重懸于10 mL磷酸鈉緩沖液中，添加0.3 g/L葡萄糖和40 mmol/L PPA，于37℃、200 r/min條件下反應，每20 min取500 μL轉化液于4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min，上清液進行HPLC檢測產物L-PLA和底物PPA濃度[30-31]。

1.3.6 HPLC分析方法

全細胞轉化液經10 000 r/min離心5 min后，上清液與脫氣流動相混合均勻，經0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC檢測L-PLA物質的量和光學純度。PPA和L-PLA定量檢測和手性分析條件參考文獻[28]。L-PLA光學純度檢測條件為：手性柱OJ-RH、流動相乙腈-甲醇-三氟乙酸-去離子水（50∶50∶1.5∶900，V/V）、流速0.3 mL/min、柱溫30 ℃、檢測波長210 nm、進樣量5 μL[32]。光學純度用對映體過量（enantionmeric excesses，ee）值表示，按公式（1）計算。

式中：nL-PLA、nD-PLA分別為L-PLA、D-PLA的物質的量/mol。

1.3.7 PPA摩爾轉化率計算

PPA摩爾轉化率按公式（2）計算。

式中：nL-PLA、nPPA分別為L-PLA、PPA的物質的量/mol。

2 結果與分析

2.1 ldhL和gdh基因克隆及重組質粒的構建

圖2 2 ldhLldhL和gdhgdh基因PCR擴增產物電泳圖（A）和重組表達質粒pETDuet-Duet-ldhLldhL-gdhgdh雙酶切驗證（B）BFig. 2 PCR-amplified products of ldhL and gdh (A) and double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pETDuetldhL-gdh (B)

以B. megaterium Z2013513基因組為模板分別進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳和測序結果均表明，ldhL基因長度為957 bp，gdh基因長度為786 bp，與NCBI公布B. megaterium WSH-002序列大小相符，序列相似度99%（圖2A）。重組表達質粒pETDuet-ldhL-gdh經雙酶切驗證結果表明，gdh和ldhL均已成功連接（圖2B）。

2.2 ldhL和gdh誘導表達及酶活力測定

圖3 SDS-PAGE分析重組E. ccoollii L-LDH和GDH蛋白表達Fig. 3 SDS-PAGE analysis of L-LDH and GDH coexpression in recombinant E. coli

圖3 為SDS-PAGE電泳分析經IPTG誘導后，E. coli BL21（DE3）、重組E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh中ldhL和gdh基因的蛋白表達情況。與原始菌E. coli BL21（DE3）相比，E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh均在35～40 kD范圍內有特異性條帶，且攜帶雙基因表達質粒pETDuet-ldhL-gdh中ldhL的表達量明顯低于攜帶單基因表達質粒pETDuet-ldhL。E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh在25～29 kD范圍內的特異性條帶與GDH蛋白分子質量大小相符。SDS-PAGE結果表明E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh能成功轉錄并表達L-LDH和GDH蛋白。

表2 重組大腸桿菌中L-LDH和GDH比活力分析Table2 Specific activities off LL-LDH and GDH of recombinant strains U/mg

測定3 種菌株粗酶液中L-LDH和GDH比活力（表2），未檢測出重組菌株E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和原始菌株E. coli BL21（DE3）裂解上清液中GDH的比活力，而重組菌株E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh裂解上清液中L-LDH和GDH比活力分別為0.21 U/mg和6.53 U/mg，說明重組ldhL和gdh在大腸桿菌中成功表達且具有酶學活性。

2.3 輔因子再生偶聯體系轉化PPA合成L-PLA

圖4 E. ccoollii BL21（DDEE33）/pETDDuueett--llddhhLL-ggddhh和E. ccoollii BL21（DDEE33）/ pETDDuueett--llddhhLL轉化對比圖Fig. 4 Time course of L-PLA production by E. coli BL21(DE3)/ pETDuet-ldhL-gdh or E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL

全細胞轉化試驗表明兩株重組菌E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL和E. coli BL21（DE3）/pETDuetldhL-gdh均能夠轉化PPA立體特異性合成L-PLA。E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL的L-LDH表達量較高，比酶活力約是E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh的L-LDH的2 倍（表2），但在轉化過程中，由于缺乏輔因子NADH，限制L-LDH的催化反應，不利于L-PLA的合成。而E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh細胞中GDH不斷將葡萄糖催化生成葡萄糖酸，同時也伴隨著NAD＋轉化成輔酶NADH，保持菌體代謝中的輔酶平衡，才使得細胞內足夠的輔因子促使L-LDH以較高的反應速率催化PPA不對稱合成L-PLA。反應40 min以后，因底物消耗殆盡而反應速率降低。相比E. coli BL21（DE3）/pETDuetldhL，E. coli BL21（DE3）/pETDuet-ldhL-gdh轉化L-PLA為24.26 mmol/L，提高18.92%；底物PPA摩爾轉化率為59.55%，提高17.42%（圖4）。

圖5 HPLCC分析E. ccoollii BL21（DDEE33）/pETDDuueett--llddhhLL-ggddhh全細胞轉化產物L-PLA光學純度Fig. 5 HPLC analysis of L-PLA production by whole cells of E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh

由圖5可知，HPLC手性分析結果表明此輔因子再生偶聯體系不對稱還原PPA合成的L-PLA光學純度高達99%。雖然此輔因子再生體系的誘導表達和全細胞轉化條件需要進一步優化以提高L-PLA產量和底物摩爾轉化率，但是其立體特異性選擇有助于合成光學純L-PLA，為其在醫學和食品行業中廣泛應用提供參考依據。

3 結 論

輔因子再生對于生物體內大多數氧化還原反應持續進行具有重要的意義，既避免在反應過程中外部添加昂貴的輔因子，又緩解細胞內輔因子水平的限制，提高氧化還原反應催化效率。菌株Rubrivivax benzoatilyticus JA2[14]轉化1 mmol/L苯丙氨酸合成0.92 mmol/L L-PLA。篩選自土壤的假單胞菌菌株Pseudomonas sp.BC-18能將2-羥基-3-苯基丙腈轉化得光學純度為75%的L-PLA[32]。本研究設計了輔因子NADH再生途徑，通過引入gdh和ldhL，底物葡萄糖不僅為細胞提供能量，也實現NAD/NADH在細胞內的平衡，促進L-PLA的大量積累。同時，良好的光學純度是L-PLA合成重要手性藥物的前提。此微生物全細胞一步轉化法條件溫和、工藝簡單，為L-PLA工業化生產提供一定的參考依據。

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Production of Optically Pure L-Phenyllactic Acid by Using Whole Cells of Recombinant Escherichia coli

ZHU Yibo1, LU Rubin1, CHENG Jun1, WANG Ying1,2, QI Bin1, WANG Limei1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Suzhou 215500, China; 2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

The L-lactate dehydrogenase gene (ldhL) and glucose dehydrogenase gene (gdh) were respectively amplified from Bacillus megaterium Z2013513 by PCR and inserted into the plasmid pETDuet-1 to construct the recombinant vector pETDuet-ldhL-gdh. Then, the vector was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) to obtain the recombinant strain E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and enzymatic activity analysis showed that both ldhL and gdh were successfully co-expressed with biological functions in the recombinant strain. Using whole cells of recombinant E. coli BL21(DE3)/pETDuet-ldhL-gdh, 24.26 mmol/L L-phenyllactic acid was obtained from phenylpyruvic acid at 37 ℃ and 200 r/min after 60 min transformation. The product enantiomeric excess percent was over 99% with substrate molar conversion rate of 59.55%. The results showed the cofactor regeneration biotransformation system was capable of eff ciently producing optically pure L-phenyllactic acid.

L-2-hydroxyl-3-phenylpropionic acid; Bacillus megaterium Z2013513; L-lactate dehydrogenase; glucose dehydrogenase; NADH regeneration; whole-cell catalysis

10.7506/spkx1002-6630-201702010

TS201.2

A

1002-6630（2017）02-0059-06

朱益波, 魯如彬, 程俊, 等. 重組大腸桿菌合成光學純L-苯基乳酸[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 59-64. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702010. http://www.spkx.net.cn

ZHU Yibo, LU Rubin, CHENG Jun, et al. Production of optically pure L-phenyllactic acid by using whole cells of recombinant Escherichia coli[J]. Food Science, 2017, 38(2): 59-64. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702010. http://www.spkx.net.cn

2016-03-26

國家自然科學基金青年科學基金項目（31501459）；國家自然科學基金面上項目（31470092）；江蘇省基礎研究計劃（自然科學青年基金）項目（BK20130380）；常熟市科技計劃項目（CN201412）

朱益波（1980—），男，博士，研究方向為微生物與生物技術。E-mail：centuryrain@126.com

*通信作者：王立梅（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wlmqb@126.com