牛骨血管緊張素轉化酶抑制肽發酵動力學及結構與特性分析

劉麗莉，李 丹，尹光俊，梁嚴予，康懷彬

牛骨血管緊張素轉化酶抑制肽發酵動力學及結構與特性分析

劉麗莉，李 丹，尹光俊，梁嚴予，康懷彬

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003）

前期篩選蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus MBL13-U），結合嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）混合發酵牛骨粉制備血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，對其發酵動力學進行研究，采用Logistic和Luedeking-Piret等方程對發酵過程進行非線性擬合，建立發酵過程中菌體生長、產物生成、基質消耗動力學模型，擬合度均高于0.97。通過掃描電鏡、紫外掃描、差示掃描量熱儀對ACE抑制肽進行結構表征。結果表明，由于牛骨ACE抑制肽具有良好的吸濕性，其在掃描電鏡下表面出現明顯的溝壑痕跡；在222 nm波長處出現強吸收峰，符合膠原多肽的特征吸收；與牛骨膠原蛋白相比，其熱變性溫度升高，熱穩定性較強。同時對其特性分析表明，牛骨ACE抑制肽具有較好的溶解性、較強的耐酸堿性，在0.9 mol/L以內的NaCl濃度條件下耐鹽性較強，胃腸道酶對牛骨ACE抑制肽的影響較小。

蠟樣芽孢桿菌；牛骨血管緊張素轉化酶抑制肽；發酵動力學；結構表征；特性

高血壓是一種慢性疾病，是引發心腦血管疾病的重要危險因素之一，據估計，在2025年，全球超過1.5億 人將被診斷出患有高血壓[1]，高血壓的預防和治療已經成為國內外研究學者共同關注的問題。血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種多功能性的酶，它是腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統的主要調節器，在血壓的調節方面起著重要的作用[2-3]。ACE抑制劑是治療高血壓和心血管疾病使用較多的藥物，但多數為合成的ACE抑制劑，一些降壓藥如卡托普利、賴諾普利，會產生咳嗽、皮疹、腎功能損害和血管神經性水腫等副作用[4]，因此研究者在尋求一些來源于天然產物的安全可靠的ACE抑制劑。

資料表明，膠原蛋白經水解后產生的膠原多肽對血管緊張素轉化酶起到了有效的抑制作用，在新的治療和功能性食品領域具有潛在的發展[5]。目前從食品中制備ACE抑制肽的方法主要為酶解法[6]。國內外研究學者已經從多種蛋白水解物中成功獲得了ACE抑制肽[7-9]，如Mirzaei等[7]將胰蛋白酶作用在酵母蛋白上，將水解產物經過超濾和色譜分離制備ACE抑制肽并研究其穩定性。近年來隨著畜產品需求的增加，骨骼的開發利用受到了極大的關注，骨骼中含有豐富的膠原蛋白，但是由于其特殊的三股螺旋結構很難被機體消化吸收，造成了極大的資源浪費。一些學者對酶解骨骼進行了相關研究，如舒一梅等[10]將豬骨進行酶解后分離得到的ACE抑制肽具有較好的耐熱、耐酸堿和耐鹽性，在酸性條件下具有良好的溶解性。Pagán等[11]對豬骨的酶解動力學及對膠原多肽的分子質量進行分析，探究其降解機理。Zhang Yuhao等[12]使用6 種不同的蛋白酶作用于牛骨制備ACE抑制肽，并對其氨基酸序列進行分析表明，使用適當的酶處理可以有效提高ACE抑制肽的含量。也有學者將微生物發酵與骨骼相結合進行研究，如宗紅等[13]利用枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）對豬骨泥進行聯合發酵，目的在于提高骨泥中易于吸收且具有功能的小分子蛋白、多肽及可溶性鈣的含量，強化發酵骨泥的功能性。

目前發酵骨骼以Lp為主，本課題組前期成功從自然界篩選出蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus MBL13-U，并研究了其產酶條件及降解牛骨膠原蛋白的機理[14-16]，發現牛骨是ACE抑制肽可靠無副作用的來源。在此基礎上，本研究采用蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus MBL13-U，結合嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St）、Lp混合發酵牛骨制備ACE抑制肽，構建發酵動力學模型，對制備的ACE抑制肽進行結構表征和特性分析，合理利用廢棄牛骨資源，增加其附加值，為今后工業化的生產提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛腿骨 洛陽市老城區農貿市場；蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus MBL13-U為本課題組篩選誘變所得未產生腸毒素的菌種；St、Lp為市售光明暢優乳中分離所得。

馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu，HHL）、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma化學公司；雙縮脲、鹽酸、氫氧化鈉 天津德恩化學試劑有限公司；其他化學試劑均為分析純。

發酵培養基（100 mL）：菌種接種量3%、菌種配比（Bacillus cereus MBL13-U/St/Lp體積比）1∶1∶1、蔗糖2.5 g、骨粉添加量3.5 g。

1.2 儀器與設備

Scout SE電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；BBS-V800潔凈工作臺 濟南鑫貝西生物技術有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；高速冷凍離心機 湖南湘儀儀器開發有限公司；紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；JMSC300超濾杯、PES-300聚醚砜超濾膜 上海摩速科學器材有限公司；CX21光學顯微鏡 日本Olympus公司；SM-6480掃描式電子顯微鏡 日本電子公司；DSC204F1差示掃描量熱儀 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨ACE抑制肽的制備

1.3.1.1 牛骨ACE抑制肽制備的工藝流程

新鮮牛骨→除雜→切塊（5～6 cm）→高壓蒸煮（121 ℃，0.1 kPa）→脫脂、脫鈣→水洗→烘干→粉碎（40 目篩）→牛骨粉→發酵培養基→滅菌→接種→發酵→紫外殺菌→離心取上清液→超濾分離純化→真空冷凍干燥→牛骨ACE抑制肽

1.3.1.2 牛骨ACE抑制肽的制備工藝

按本課題組前期實驗確立的最佳發酵條件進行[14]。將牛骨粉在最佳發酵條件為菌種接種量3%、菌種Bacillus cereus MBL13-U/St/Lp體積比1∶1∶1（菌體的細胞濃度均為108CFU/mL）、發酵溫度37 ℃、發酵時間42 h、初始pH 7.0條件下進行發酵，紫外殺菌（功率25 W，高度60 cm，發酵液厚度1 cm，時間10 min）后取上清液，8 000 r/min、4 ℃離心10 min除去菌體和其他大分子物質，收集上清液調節pH值至7.0，依次過截留分子質量分別為10、5、3 kD的超濾膜得到牛骨ACE抑制肽，真空冷凍干燥后收集備用。

1.3.2 發酵動力學模型的建立

最佳條件下培養的發酵液在0～48 h的連續發酵時間內每隔4 h取樣，測定不同時間條件下菌液濃度、牛骨粉含量和ACE抑制肽生成量的變化，選取合適的方程式進行擬合，構建最佳發酵動力學模型，并不定期對混合菌種進行顯微鏡觀察，以確保其發酵過程的穩定性。

1.3.3 牛骨ACE抑制肽的結構表征

1.3.3.1 ACE抑制肽的掃描電鏡分析

取少量牛骨ACE抑制肽樣品均勻涂抹于掃描電鏡樣盤雙面膠上，進行噴金鍍膜處理后置于掃描電鏡抽真空，調整電壓，放大不同倍數獲取清晰掃描圖像。

1.3.3.2 ACE抑制肽的紫外光譜分析

室溫條件下，取0.5 g分離干燥的牛骨ACE抑制肽溶于30 mL去離子水，樣品于紫外-可見光掃描儀上進行200～450 nm波長范圍的掃描[17]。

1.3.3.3 ACE抑制肽的熱變性溫度分析

采用差示掃描量熱法，稱取0.02～0.05 g牛骨ACE抑制肽樣品置于潔凈坩堝中，加蓋密封，以空白坩堝作為對照組，放入差示掃描量熱儀內，在－10～150 ℃范圍內以10 ℃/min升溫速率進行掃描。

1.3.4 ACE抑制肽的特性分析

1.3.4.1 ACE抑制肽的溶解性

取0.1 g冷凍干燥的牛骨ACE抑制肽溶于20 mL去離子水，用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調pH值至2.0～10.0，室溫條件下攪拌1 h，8 000 r/min、 4 ℃離心10 min，分別取上清液測其蛋白質含量，以考察牛骨ACE抑制肽的溶解性。ACE抑制肽溶解度為清液中蛋白質質量與樣品質量比值[10]。

1.3.4.2 ACE抑制肽的pH值穩定性

取0.1 g冷凍干燥的牛骨ACE抑制肽溶于20 mL去離子水，用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液分別調pH值至2.0～10.0，室溫條件下靜置1 h，分別測其ACE抑制率[18]。

1.3.4.3 ACE抑制肽的鹽穩定性

取0.1 g冷凍干燥的牛骨ACE抑制肽分別溶于0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7 mol/L NaCl溶液，室溫條件下靜置1 h，分別測其ACE抑制率。

1.3.4.4 ACE抑制肽的體外消化模擬

用鄧惠玲[19]的方法略加修改。將提純干燥的牛骨ACE抑制肽配成一定質量濃度的溶液，用1 mol/L HCl溶液調pH 2.0，加入2%的胃蛋白酶，37 ℃條件下水解2 h，沸水浴10 min后終止反應，將其pH值用1 mol/L NaOH溶液調至中性，先取部分水解液在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，測其ACE抑制率；再取部分水解液加入2%的胰蛋白酶，37 ℃水解2 h，沸水浴10 min后終止反應，在8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，測其ACE抑制率。

1.3.5 指標測定

菌液濃度：將混合菌種按3%的接種量接到發酵培養基中連續發酵48 h，每4 h取發酵液，靜置20 min取上清液于分光光度計600 nm波長處測定吸光度（A600nm），所測數據即可描繪菌體的生長情況。

牛骨粉含量：取發酵液于干燥好的離心管中，5 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集骨粉，于恒溫干燥箱中105 ℃干燥至恒質量，稱其質量，單位g/L。

牛骨ACE抑制肽含量：采用魯偉等[20]的方法進行測定。

ACE抑制率：在莊溪[21]所采用的方法上略加修改：取50 μL 5.0 mmol/L HHL與10 μL發酵上清液混勻，37 ℃水浴中預熱5 min，加入10 μL 0.1 U/mL ACE，37 ℃水浴中反應1 h，加入75 μL 1.0 mol/L HCl溶液終止反應。加入0.6 mL乙酸乙酯充分混勻后4 000 r/min、4 ℃離心10 min。取l mL乙酸乙酯層于試管中放入烘箱，110 ℃揮發60 min后用4 mL蒸餾水溶解，充分混合30 s，在波長228 nm處測定其吸光度。ACE抑制率計算如式（1）所示：

式中：A為加入ACE抑制肽的樣品吸光度；B為不加ACE抑制肽的樣品吸光度；C為不加ACE的樣品吸光度。

1.4 數據處理

采用Excel 2007軟件對數據進行統計分析，采用Origin 8.5軟件對數據進行非線性擬合。

2 結果與分析

2.1 牛骨ACE抑制肽的發酵動力學模型的構建

2.1.1 微生物發酵過程中代謝變化

圖1 混合菌種發酵過程代謝曲線圖Fig. 1 Metabolic curves during mixed culture fermentation

由圖1可知，在發酵前12 h內，牛骨粉消耗量很小，相應的混合菌種生長量及牛骨ACE抑制肽生成量均不明顯，此階段處于混合菌種生長的延滯期。在12～32 h階段，牛骨粉含量從31.97 g/L顯著降到17.95 g/L，牛骨ACE抑制肽的生成量也顯著增加，混合菌種快速生長，處于生長對數期。當超過32 h后，菌種的生長已經停滯處于穩定期，此時牛骨ACE抑制肽的產量依然增加，但增幅緩慢，因此，牛骨ACE抑制肽的產量與菌體的生長呈部分偶聯關系。同時不定期對混合菌種進行顯微觀察，總體表明發酵過程具有穩定性。

2.1.2 菌體生長動力學模型

由圖1可知，混合菌種的生長呈典型的S型走勢，因此選擇用由Verhulst提出的Logistic方程[22]建立模型描繪混合菌種的生長情況，Logistic方程的微分形式為：

式中：X為菌體濃度（A600nm）；Xm為最大菌體濃度（A600nm）；μ為混合菌體的最大比生長速率/h－1；t為時間/h。

對式（2）進行積分，得到：

式中：X0為初始菌體濃度（A600nm）。

用Origin 8.5軟件按式（3）對菌種濃度進行擬合，結果見圖2和表1。

圖2 混合菌種生長擬合曲線Fig. 2 Growth curve of mixed strains

表1 混合菌體生長動力學模型參數Table1 Parameters estimation for the kinetic model for the growth of mixed straaiinnss

得到的擬合方程為：

由圖2及表1可知，擬合值與實驗值基本相符，擬合的R2值為0.991 0，擬合情況良好，說明Logistic方程能較好地模擬混合菌種發酵牛骨粉過程中菌體的生長過程。在發酵初期擬合產生誤差，其原因在于Logistic方程主要是反應菌種濃度的增加和營養物質的減少對菌種自身生長抑制的影響，在混合菌種生長的延滯期，由于濃度較低，影響效果不明顯，因此造成發酵初期擬合效果相對不理想。

2.1.3 產物生成動力學模型

微生物在發酵的動態過程中細胞內的生物合成途徑十分復雜，且其代謝調節機制特點各有不同，根據產物生成速率與細胞生長速率之間的關系，將產物的形成與微生物細胞生長關系的動力學模型主要分為以下3 類：Ⅰ生長偶聯型；Ⅱ部分生長偶聯型或稱混合型；Ⅲ非生長偶聯型[23]。因此本實驗混合菌種發酵的產物牛骨ACE抑制肽生成模型采用Luedeking-Piret方程[24]，表達式為：

式中：P為發酵產物ACE抑制肽的生成量/（mg/mL）；a為與生長偶聯的產物形成系數；b為非生長偶聯的相關系數。

將式（2）、（3）、（5）積分得：

將式（4）代入式（6）得到：

式中：P0為初始牛骨ACE抑制肽含量/（mg/mL）。

采用Origin 8.5軟件按式（7）對實驗測得的發酵產物牛骨ACE抑制肽的生成量數據進行擬合，得到圖3和表2。

圖3 產物牛骨ACE抑制肽生成的擬合曲線Fig. 3 Time course for the formation of bovine bone ACE inhibitory peptides

表2 產物牛骨ACE抑制肽生成動力學模型參數Table 2 Parameters estimation for the kinetic model for the formation of bovine bone ACE inhibitory peptides

得到擬合后的方程為：

由圖3和表2可知，利用Luedeking-Piret方程對實驗測得混合菌種發酵過程產物牛骨ACE抑制肽的生成情況進行擬合，擬合度R2為0.976 0，效果較理想。在發酵后期，菌種自身質量濃度的增大和底物牛骨粉的消耗導致擬合值和實測值出現偏差，說明在發酵后期適當提高底物濃度有利于提高牛骨ACE抑制肽的產量。

2.1.4 底物消耗動力學模型

發酵過程中，認為底物骨粉的消耗主要用于發酵菌體的生長消耗和產物牛骨ACE抑制肽的合成消耗兩部分，通常采用以下方程[25]：

式中：S為骨粉含量/（g/L）；YX/S為菌體細胞得率系數；YP/S為產物得率系數；m為維持系數。

將式（2）、（3）、（5）代入式（9）得：

令：

將式（11）、（12）代入式（10）得到：

式中：S0為初始骨粉含量/（g/L）。

將式（4）代入式（13）得到：

采用Origin 8.5軟件按式（3）、（13）對測得的骨粉含量數據進行擬合，得到圖4和表3。

圖4 底物牛骨粉消耗的擬合曲線Fig. 4 Time course for substrate consumption

表3 底物牛骨粉消耗動力學模型參數Table3 Parameter estimation for the kinetic model for substrate consumption

得到擬合后的方程為：

由圖4可看出，發酵過程中，牛骨粉的消耗走勢呈現反S型，在菌種處于對數期時消耗量較大，而在菌種分別處于延滯期和穩定期時，消耗量均較平緩。經軟件擬合后的曲線與實驗測得數據較接近，且擬合決定系數R2為0.971 6，擬合情況較理想。

2.2 牛骨ACE抑制肽的結構表征

2.2.1 牛骨ACE抑制肽的掃描電鏡及紫外光譜分析

圖5 牛骨ACE抑制肽的掃描電鏡圖（×25 000000）Fig. 5 SEM image of bovine bone ACE inhibitory peptides (× 25 000)

圖6 牛骨ACE抑制肽紫外掃描圖Fig. 6 UV absorption spectrum of bovine bone ACE inhibitory peptides

如圖5所示，牛骨ACE抑制肽表面出現了明顯的溝壑痕跡，可能是由于牛骨ACE抑制肽的親水區具有較強的吸濕性，接觸空氣后極易吸水，在掃描過程中的真空環境下失水所造成的。

在波長200～230 nm之間，膠原多肽的羰基及肽鍵有特征吸收峰[26]。牛骨ACE抑制肽的紫外掃描結果如圖6所示，牛骨ACE抑制肽在波長214～222 nm之間出現強吸收峰，在280 nm處無吸收峰出現，這是因為牛骨膠原蛋白水解后得到的ACE抑制肽鏈中含有的CO—NH2、C—O、—COOH都是生色基團，能夠在220 nm波長左右產生光吸收[27]。因此所制備的ACE抑制肽符合膠原多肽的特性吸收。

2.2.2 牛骨ACE抑制肽的熱變性溫度分析

圖7 牛骨ACE抑制肽和牛骨膠原蛋白的差示掃描量熱曲線Fig. 7 DSC curves of bovine bone ACE inhibitory peptides and bovine bone collagen

膠原的熱穩定性通常以其熱變性溫度來表示，牛骨粉蛋白含量中以Ⅰ型膠原蛋白為主，分別對牛骨膠原蛋白和牛骨ACE抑制肽進行熱變性溫度測定，結果如圖7所示，牛骨膠原蛋白的熱變性溫度為69.93 ℃，此時，膠原特有的三螺旋結構被破壞，轉變為無規則的卷曲狀，導致膠原喪失部分生物性質，即為膠原的熱變性過程。而牛骨ACE抑制肽的熱變性溫度為87.65 ℃，高于牛骨膠原蛋白，可知膠原蛋白經發酵降解為多肽，隨著其分子質量的降低，熱變性溫度升高，相較于膠原蛋白，牛骨ACE抑制肽的熱穩定更強。

2.3 牛骨ACE抑制肽的特性分析

2.3.1 牛骨ACE抑制肽的溶解性和pH值穩定性

圖8 ACE抑制肽的溶解性曲線及pH值對ACE抑制肽活性的影響Fig. 8 Solubility curve and influence of pH on the activity of ACE inhibitory peptides

針對不同pH值情況下ACE抑制肽的溶解性及ACE抑制率的測定結果如圖8所示，改變多肽液的pH值，其溶解度始終保持在88 g/100 g左右，變化幅度并不明顯，并且牛骨ACE抑制肽的抑制率始終維持在66.3%～67.2%范圍內，并不隨pH值的變化而變化，說明牛骨ACE抑制肽具有較好的溶解性，且受pH值的影響不顯著。與王艷[28]研究的魚皮膠原蛋白的溶解性相比，牛骨ACE抑制肽的溶解性較強且對酸堿均較穩定，可能由于膠原蛋白經微生物發酵為短肽后，分子有卷曲狀變為伸展狀，離子性增強，從而大大提高了其溶解性，并在酸堿情況下具有較好的穩定性。

2.3.2 牛骨ACE抑制肽的鹽穩定性

圖9 NaCl濃度對ACE抑制肽活性的影響Fig. 9 Effect of NaCl concentration on the activity of ACE inhibitory peptides

如圖9所示，當NaCl溶液濃度在0.1～0.9 mol/L時，牛骨ACE抑制肽的活性波動范圍比較小，幾乎不受NaCl濃度的影響，當NaCl溶液濃度超過0.9 mol/L時，牛骨ACE抑制肽的活性隨NaCl溶液濃度的增加而顯著降低。因此，在0.9 mol/L以內的NaCl濃度條件下牛骨ACE抑制肽具有較強的耐鹽性。

2.3.3 牛骨ACE抑制肽對胃腸道蛋白酶耐受性

食品來源的ACE抑制劑之所以具有有效降壓的作用，是因為它不能被消化道內的酶系降解，可以到達抑制ACE的作用位點。如果其被消化道內的酶系降解，分解成不具有抑制作用的片段，即使在體外具有ACE抑制活性也是毫無意義的，因此研究其抗消化道酶解能力至關重要[29]。

圖10 胃腸道酶對牛骨ACE抑制肽的影響Fig. 10 Effect of gastrointestinal proteases on bovine bone ACE inhibitory peptides

牛骨ACE抑制肽在模擬胃腸道環境下，經胃蛋白酶和胰蛋白酶體外消化后測其ACE抑制率變化情況如圖10所示，牛骨ACE抑制肽在分別經胃蛋白酶和胰蛋白酶及兩種酶同時消化后ACE抑制率變化不顯著，說明該肽對胃腸道環境中胃蛋白酶及胰蛋白酶具有一定的抗性，在體內可通過胃腸道吸收而進入血液，從而發揮降血壓作用。

3 結 論

采用Logistic和Luedeking-Piret等方程對混合菌種發酵牛骨粉的過程進行非線性擬合，建立發酵過程中菌體生長、牛骨ACE抑制肽生成、牛骨粉消耗動力學模型。實驗數據與預測值擬合良好，其擬合度分別為0.991 0、0.976 0、0.971 6，證明本實驗構建的發酵動力學模型能較好模擬混合菌種對牛骨粉的發酵過程。模型的建立可以更直觀了解在發酵過程中菌體生長、牛骨ACE抑制肽的生成、牛骨粉消耗的情況，為后期工業化生產提供理論參考依據。

對牛骨ACE抑制肽的結構及特性分析表明：牛骨ACE抑制肽具有較好的吸濕性，在掃描電鏡下其表面呈現出溝壑痕跡，與其具有較強的吸濕性有關；牛骨ACE抑制肽的最大峰值在波長222 nm左右，符合膠原多肽的特征吸收；牛骨ACE抑制肽的熱變性溫度為87.65 ℃，與牛骨膠原蛋白相比，其熱變性溫度升高，具有較強的熱穩定性；同時牛骨ACE抑制肽具有較好且穩定的溶解性和較強的耐酸堿性；在0.9 mol/L以內的NaCl濃度條件下具有較強的耐鹽性；耐受胃腸道蛋白酶消化作用，為其在食品及藥品工業領域的開發使用提供理論依據。

[1] SHIH Y H, TSAI S F, HUANG S H, et al. Hypertension impairs hippocampus-related adult neurogenesis, CA1 neuron dendritic arborization and long-term memory[J]. Neuroscience, 2016, 322: 346-357. DOI:10.1016/j.neuroscience.2016.02.045.

[2] YAMAMOTO N. Antihypertensive peptides derived from food proteins[J]. Annual Review of Food Science and Technology, 2015, 6(2): 235-262. DOI:10.1146/annurev-food-022814-015520.

[3] NORRIS R, O’KEEFFE M B, POYARKOV A, et al. Peptide

identification and angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity in prolyl endoproteinase digests of bovine αs-casein[J]. Food Chemistry, 2015, 188: 210-217. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.04.130.

[4] ELAVARASAN K, SHAMASUNDAR B A, FARAHA B, et al. Angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity and structural properties of oven- and freeze-dried protein hydrolysate from fresh water f sh (Cirrhinus mrigala)[J]. Food Chemistry, 2016, 206: 210-216. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.03.047.

[5] FANG H, LUO M, SHENG Y, et al. The antihypertensive effect of peptides: a novel alternative to drugs?[J]. Peptides, 2008, 29(6): 1062-1071. DOI:10.1016/j.peptides.2008.02.005.

[6] ECKERT E, ZAMBROWICA A, POKORA M, et al. Egg-yolk protein by-product as a source of ACE-inhibitory peptides obtained with using unconventional proteinase from Asian pumpkin (Cucurbita f cifolia)[J]. Journal of Proteomics, 2014, 110: 107-116. DOI:10.1016/ j.jprot.2014.08.003.

[7] MIRZAEI M, MIRDAMADI S, EHSANI M R, et al. Purification and identification of antioxidant and ACE-inhibitory peptide from Saccharomyces cerevisiae protein hydrolysate[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 19: 259-268. DOI:10.1016/j.jff.2015.09.031.

[8] YU W, GAO J, XUE Z, et al. Radical-scavenging activity, ACE-inhibiting capability and identification of rapeseed albumin hydrolysate[J]. Food Science and Human Wellness, 2013, 2(2): 93-98. DOI:10.1016/j.fshw.2013.05.002.

[9] JIA J, WU Q, YAN H, et al. Purif cation and molecular docking study of a novel angiotensin-? converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from alcalase hydrolysate of ultrasonic-pretreated silkworm pupa (Bombyx mori) protein[J]. Process Biochemistry, 2015, 50(5): 876-883. DOI:10.1016/j.procbio.2014.12.030.

[10] 舒一梅, 李誠, 付剛, 等. 凝膠層析法分離豬股骨降血壓肽及其體外穩定性[J]. 食品科學, 2014, 35(24): 100-104. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201424019.

[11] PAGáN J, IBARZ A, FALGUERA V, et al. Enzymatic hydrolysis kinetics and nitrogen recovery in the protein hydrolysate production from pig bones[J]. Journal of Food Engineering, 2013, 119(3): 655-659. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2013.06.040.

[12] ZHANG Y H, OLSEN K, GROSSI A, et al. Effect of pretreatment on enzymatic hydrolysis of bovine collagen and formation of ACE-inhibitory peptides[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 2343-2354. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.05.058.

[13] 宗紅, 諸葛斌, 秦斌鈺, 等. 功能性豬骨泥發酵工藝研究[J]. 中國調味品, 2014, 39(2): 31-35. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2014.02.008. [14] 劉麗莉, 康懷彬, 任廣躍, 等. 微生物發酵牛骨粗膠原蛋白制備膠原多肽[J]. 肉類工業, 2013(6): 23-28. DOI:10.3969/ j.issn.1008-5467.2013.06.008.

[15] LIU L L, MA M H, CAI Z X, et al. Purif cation and properties of a collagenolytic protease produced by Bacillus cereus MBL13 strain[J]. Food Technology and Biotechnology, 2010, 48(2): 151-160.

[16] 劉麗莉, 馬美湖, 楊協力. 產骨膠原蛋白酶菌的篩選及發酵條件優化[J]. 食品科學, 2009, 30(增刊1): 49-53. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.z1.012.

[17] 李振飛. 羊軟骨中膠原蛋白肽的提取及其抗氧化性研究[D]. 呼和浩特: 內蒙古農業大學, 2013: 9-17.

[18] 陳飛平. 莧籽ACE抑制的分離純化及其性質評價[D]. 重慶: 西南大學, 2013: 65-68.

[19] 鄧惠玲. 豬血紅蛋白ACE抑制肽的制備及其理化性質研究[D]. 重慶: 西南大學, 2013: 35-38.

[20] 魯偉, 任國譜, 宋俊梅. 蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J]. 食品科學, 2005, 26(7): 169-171. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2005.07.039.

[21] 莊溪. 酶法制備大越豆芋ACE抑制肽的研究[D]. 杭州: 浙江農林大學, 2013: 32-36.

[22] 王濤, 張書衍, 吳綿斌, 等. 一株產新型水溶性抗真菌化合物的海洋芽胞桿菌發酵動力學的研究[J]. 高校化學工程學報, 2014, 28(6): 1294-1301. DOI:10.3969/j.issn.1003-9015.2014.06.018.

[23] 韋曉菊, 黎繼烈, 朱曉媛. 重組大腸桿菌產青霉素酰化酶的發酵動力學研究[J]. 中國釀造, 2014, 33(3): 32-35. DOI:10.3969/ j.issn.0254-5071.2014.03.009.

[24] 張志東, 王瑋, 茆軍, 等. 低溫淀粉酶發酵動力學模型的研究[J]. 食品科學, 2009, 30(3): 137-140. DOI:10.3321/j.iss:1002-6630.2009.03.030.

[25] 徐慧, 劉建軍. 枯草芽孢桿菌HB-32產3-羥基丁酮分批發酵動力學[J].食品科學, 2013, 34(13): 209-212. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201313044.

[26] 祝德義, 李彥春, 靳麗強. 膠原多肽與鈣結合性能的研究[J]. 中國皮革, 2005, 34(3): 26-29. DOI:10.3969/j.issn.1001-6813.2005.03.009.

[27] 楊露, 丁利君, 藍德安. 馬面魚骨膠原多肽的理化特性及其抗氧化活性[J]. 食品科學, 2013, 34(11): 109-112. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201311024.

[28] 王艷. 草魚皮膠原蛋白的提取、性質研究及膜性能表征[D]. 天津:天津科技大學, 2013: 45-46.

[29] 楊鋒, 馬千里, 黃永春. 醋蛋中ACE抑制肽的分離及穩定性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(24): 77-79. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.24.014.

Fermentation Kinetics, Structure and Characteristics of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides Derived from Bovine Bone

LIU Lili, LI Dan, YIN Guangjun, LIANG Yanyu, KANG Huaibin
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

In this work, we conducted a kinetic study on the mixed culture fermentation of bovine bone meal with Bacillus cereus MBL13-U, which was isolated in our previous study, Streptococcus thermophilus and Lactobacillus plantarum for preparing angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides. Kinetic models with a determination coefficient greater than 0.97 for cell growth, product formation and substrate consumption were developed through nonlinear fitting using Logistic equation and Luecleking-Piret equation. The model predictions were in good agreement with the measured values. The structural properties of the ACE inhibitory peptides were characterized by scanning electron microscopy (SEM), ultraviolet (UV) spectroscopy and differential scanning calorimetry (DSC). The results showed that gully marks appeared on the surface of bovine bone-derived ACE inhibitory peptides, because they had a strong moisture absorption capacity with the maximum absorption at 222 nm as collagen-derived peptides do. Besides, the ACE inhibitory peptides had an increased thermal denaturation temperature and a better thermal stability than bovine bone collagen, apart from good solubility, acid and alkali resistance, and their salt tolerance was strong when the NaCl concentration was below 0.9 mol/L. Pepsin and trypsin had slight effects on bovine bone ACE inhibitory peptides.

Bacillus cereus MBL13-U; angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides; fermentation kinetic models; structure characterization; characteristics

10.7506/spkx1002-6630-201702009

TS253.1

A

1002-6630（2017）02-0052-07

劉麗莉, 李丹, 尹光俊, 等. 牛骨血管緊張素轉化酶抑制肽發酵動力學及結構與特性分析[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 52-58. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702009. http://www.spkx.net.cn

LIU Lili, LI Dan, YIN Guangjun, et al. Fermentation kinetics, structure and characteristics of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine bone[J]. Food Science, 2017, 38(2): 52-58. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702009. http://www.spkx.net.cn

2016-04-28

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401622）；公益性行業（農業）科研專項（201303084）；河南省重點攻關項目（152102110080）；河南科技大學高級別項目培育基金項目（2013ZCX012）；河南省教育廳自然科學研究項目（13A550255）

劉麗莉（1974—），女，副教授，博士，研究方向為畜產品加工技術。E-mail：yangliuyilang@126.com