單增李斯特菌nox基因的克隆、表達以及功能

吳 嫚，李 森，陳國薇，羅 勤，劉武康，丁承超，董慶利，劉 箐,*

單增李斯特菌nox基因的克隆、表達以及功能

吳 嫚1，李 森1，陳國薇1，羅 勤2，劉武康1，丁承超1，董慶利1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.華中師范大學生命科學學院，湖北 武漢 430079）

以GenBank中報道的單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）野生型菌株EGDe的nox基因（GenBank ID：986631）為研究對象，探討在高等動植物中普遍存在的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在Lm中是否也可以介導產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。首先通過誘導nox基因在BL21中表達產生Nox蛋白，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot鑒定該蛋白質分子質量；然后構建過表達菌株EGDe-nox，測定ROS產生情況，并使用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應檢測nox基因的過表達對Lm毒力基因表達的影響。結果表明，經鑒定Nox蛋白分子質量約為33 kD，過表達菌株EGDe-nox與對照組EGDe的ROS產生量相比并無多大變化，nox基因的過表達會導致與侵襲相關的基因actA、inlA和inlB以及毒力基因prfA的表達上調。由此推測，該Nox蛋白不能獨立主導ROS的產量，但其過表達卻可以增強毒力基因表達上調。本研究為繼續探討細菌中Nox的作用提供一定的參考依據。

單增李斯特菌；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶；nox基因；活性氧

單核細胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是革蘭氏陽性兼性厭氧菌，能引起多種人畜共患疾病，是公認的具有嚴重危害的食源性致病菌之一[1]。Lm可穿透腸道、血腦、胎盤屏障，感染后易造成孕婦死產、流產、腦膜炎和胃腸道疾病等，所引起的死亡率高達20%～30%[2-3]，因此是胞內寄生菌的模式菌株。有研究發現，Lm在面臨抗生素、溫度、高鹽等的脅迫后，可以迅速聚集、形成胞外多糖最后形成菌膜（biofilm，BF）來對應脅迫環境[4]，因此在食品加工過程中可黏附在食品加工設備上難以清除，造成食品加工的二次污染[5-6]。近年有證據顯示，菌膜的形成與活性氧（reactive oxygen species，ROS）有關[7-9]，但細菌中ROS的產生機制尚不完全清晰。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NAD(P)H oxidase），簡稱NAD(P)H氧化酶，是一種高等動植物細胞產生ROS的最主要酶之一。該酶由gp91phox、p22phox、p40phox、p47phox和p67phox 5 個亞基組成，gp91phox和p22phox位于質膜上，當與細胞漿中的另外幾種亞基結合則可形成有活性的NAD(P)H氧化酶復合體[10]。其中gp91phox是關鍵亞基，共有7 種亞型，分別由7 個基因（nox1、nox2、nox3、nox4、nox5、Duox1和Duox2）編碼，統稱noxs。NAD(P)H氧化酶有一個共同特點就是對多種環境脅迫敏感并可被瞬時激活，而由其介導產生的ROS則可參與多種細胞信號轉導及基因表達調控[11-13]。其中作為動植物NAD(P)H氧化酶家族中的一員，NADH氧化酶已被證明在多數微生物中存在[14]。在動植物細胞中NAD(P)H氧化酶的組成及功能已經有很透徹的研究，但在細菌中，和高等動植物功能相近的NADH氧化酶僅有初步研究，按照其底物及所產生ROS的不同，在細菌中將該酶初步統稱NOX，而由于尚不清楚該酶是由哪種基因編碼，所以在細菌中統稱為nox基因。Derr等[15]在研究變異鏈球菌nox敲除株在酸環境和氧環境下NADH氧化酶的功能時得出結論，nox的缺失會使氧化應激反應酶超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶的活性提高，進而會導致缺失菌株很難適應氧環境；與此相反，nox的缺失會提高菌株在低pH值環境下的生長能力。Liu Juanjuan等[16]通過加入H2O2和魚藤酮抑制劑來研究ROS對萊氏野村菌微菌核產生的影響，結果發現ROS可以促進微菌核的發展，并且還進一步發現nox基因與胞內H2O2的產生有關。1991年Patchett等[17]在研究單增李斯特菌（NCTC 7973）有氧代謝過程中，通過外源加入呼吸鏈抑制劑的方法，首次證實單增李斯特菌中存在Noxs酶活性，且其活性部位存在于細胞膜上，但是關于單增李斯特菌中的Noxs后續無更深入的報道。近年來GenBank中報道的不同血清型的nox基因序列多達8 種，但關于這些基因的功能尚無報道。為了進一步研究Lm中Noxs的功能，本研究從NCBI基因庫中找到了來自Lm的疑似nox基因的序列（GenBank ID：986631，633 bp），克隆該基因并誘導產生Nox蛋白，利用Western blot來進一步鑒定該重組蛋白，并且構建nox基因過表達菌株來研究該nox基因的過表達對ROS生成的影響，以及nox的過表達對Lm中毒力基因的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

野生型單核細胞增生李斯特菌株EGDe及穿梭載體pERL3（含有紅霉素抗生素標記）為華中師范大學生命科學學院羅勤老師饋贈；表達載體pET30a為南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室張紅生老師饋贈。

1.1.2 培養基與試劑

腦心浸液培養基、酵母浸粉 北京陸橋技術股份有限公司；胰蛋白胨 國藥集團化學試劑有限公司。

限制性內切酶XhoⅠ和SalⅠ、rTaq DNA聚合酶、dNTP mix、DNA marker、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶TaRaKa公司；抗His-tag兔多克隆抗體、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；山羊抗兔抗體 美國LI-COR公司；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

熒光實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀 美國Applied Biosystems公司；G：BOX凝膠成像系統 英國Syngene公司；瓊脂糖凝膠電泳設備、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）設備 美國Bio-Rad公司；SpectraMax M2酶標儀 美國Molecular Devices公司；Odyssey雙色紅外激光成像系統 美國LI-COR公司。

1.3 方法

1.3.1 EGDe中nox基因的驗證

表1 實驗中用到的PCR引物Table1 PCR primers used in this study

用引物nox-F、nox-R（表1）對Lm野生型菌株EGDe進行nox基因片段擴增，PCR程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸70 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min。然后利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，之后進行重組載體T-nox的構建。

1.3.2 重組質粒T-nox的構建

使用pMD-19-T載體與nox基因連接，然后轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α。挑取單菌落擴大培養后抽提質粒進行PCR（引物nox-F和nox-R）和XhoⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定。鑒定為陽性的克隆由華大科技公司測序，并將測序正確的陽性克隆命名為T-nox。

1.3.3 表達載體pET30a-nox的構建

以質粒T-nox為模板，用引物nox-F和nox-R擴增nox基因。用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切nox基因和載體pET30a，然后利用T4DNA連接酶將目的片段與載體相連接，重組質粒pET30a-nox轉化入BL21大腸桿菌感受態細胞。挑取單菌落擴大培養后抽提質粒進行PCR（引物nox-F和nox-R，PCR程序見1.3.1節）和XhoⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定。鑒定為陽性的克隆由華大科技公司測序，并將測序正確的陽性克隆分別命名為pET30a-nox。

1.3.4 重組蛋白的表達條件下

37 ℃搖床培養100 mL含有重組質粒pET30a-nox的BL21菌，OD值為0.7后，取10 mL作對照，剩下的菌液中加入IPTG誘導，終濃度為0.1 mmol/L，37 ℃、200 r/min條件下繼續培養4 h后，對照組和誘導組分別使用低溫高速離心機，8 000 r/min離心6 min，收集菌體沉淀。重懸于4 ℃預冷的PBS緩沖液中，混勻，8 000 r/min離心6 min洗滌3 次，收集菌體沉淀于PBS中，冰浴超聲破菌，4 ℃條件下8 000×g離心20 min，收集上清液[18]。

重組蛋白經膠濃度為15%的SDS-PAGE，考馬斯亮藍R-250染色檢測蛋白表達。脫色方法：倒入脫色液，恒溫振蕩儀上搖晃脫色，脫色液顏色變深后，倒掉液體重新加入脫色液，搖晃，重復該步多次，直至膠的顏色接近透明，取出，觀察。

1.3.5 Western blot鑒定

重組蛋白經SDS-PAGE后電轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene f uoride，PVDF）上，用10%脫脂奶粉輕搖封閉2 h，TBST（Tris-HCl緩沖鹽溶液＋吐溫）緩沖液沖洗3 次，加入用10 mg/mL 牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）稀釋的抗His-tag兔多克隆抗體，于4 ℃條件下輕搖過夜，TBST洗3 次，再加入用BSA稀釋的山羊抗兔抗體避光輕搖1 h，避光用TBST洗3 次，掃描觀察條帶。

1.3.6 nox過表達菌株的構建

按照1.3.3節的方法構建重組質粒pERL3-nox，并電轉入Lm野生型菌株EGDe中。通過抗性板子篩選，PCR鑒定（PCR程序見1.3.1節），將陽性克隆命名為EGDe-nox。

1.3.7 過表達菌株EGDe-nox的活性氧測定

由于該過表達菌株在培養時需加紅霉素，所以本實驗把空載體pERL3電轉入EGDe中作對照菌并命名為EGDe-pERL3。菌株EGDe-nox和EGDe-pERL3挑單菌落過夜培養，第2天以1∶100的比例擴大培養，直至OD600nm達到0.3，各取1 mL菌液8 000 r/min離心6 min，去上清液，并用PBS（pH 7.4）重懸浮，加入20 μmol/L DCFH-DA混勻，吸取150 μL重懸液加入96 孔細胞培養板中，每種菌6 個平行。密封后置于37 ℃條件下避光保存，0.5 h和1 h后用酶標儀檢測每孔菌液的熒光值（λ488nm～λ530nm）。DCFH-DA本身沒有熒光，但是它可以穿透細胞膜，進入細胞內后被酯酶水解生成DCFH，而細胞里的ROS將無熒光的DCFH氧化成有熒光的7’-二氯熒光素（7’-dichlorofluorescein，DCF），因此檢測DCF的熒光可間接反映細胞內ROS的水平[19]。

1.3.8 EGDe過表達nox基因后對其毒力基因的影響

吸取5 mL重懸菌液，靜置于37 ℃培養箱中培養3 h后添加1 mL苯酚-乙醇（1∶9，V/V）4 ℃低溫混合液，冰上孵育30 min。將樣品5 000×g離心5 min，收集沉淀菌體。將沉淀菌體用裂解液（包含50 μL 250 U/mL的變溶菌素和50 μL 25 mg/mL的溶菌酶）進行重懸，超聲溶解30 min。采用Trizol法提取裂解液中的RNA。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit將RNA反轉錄成cDNA，以制得的cDNA作為模板進行qRT-PCR實驗。

2 結果與分析

2.1 nox基因的克隆與表達

2.1.1 EGDe中nox基因的鑒定結果

圖1 PCR鑒定EGDee中的nnooxx基因結果Fig. 1 Detection of nox from EGDe by PCR

利用引物nox-F和nox-R對EGDe進行nox基因的擴增，結果如圖1所示，泳道1、2為EGDe的nox基因的擴增產物，從圖中可看到在633 bp處皆有目的條帶出現，說明在EGDe中有nox基因序列存在。

2.1.2 重組載體T-nox的構建結果鑒定

圖2 重組載體T-nnooxx的PCR（A）及雙酶切（B）鑒定結果Fig. 2 Detection of recombinant vector T-nox by PCR (A) and identification by double restriction enzyme digestion (B)

利用引物nox-F和nox-R對陽性克隆進行PCR鑒定，結果如圖2A所示，得到如預期大小（633 bp）的PCR產物；圖2B顯示的是用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切之后的結果，上面的條帶是T載體，下面的條帶則是嵌合的基因nox。這兩種鑒定結果證明nox基因已正確和T載體連接，測序結果正確率達到99%以上，進一步證明連接正確。

2.1.3 重組載體pET30a-nox構建結果鑒定

圖3 重組質粒pET300aa--nnooxx的PCR（A）和雙酶切（B）鑒定結果Fig. 3 Detection of recombinant plasmid pET30a-nox by PCR (A) and identification by double restriction enzyme digestion (B)

重組質粒pET30a-nox鑒定結果如圖3A、B所示，A圖是用引物nox-F和nox-R對10 個單克隆進行PCR鑒定，泳道2、4、8在633 bp處出現目的條帶，說明這3 個單克隆為陽性克隆；對陽性克隆進行XhoⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，結果如圖B泳道11～22，在5 000 bp上一點各有一條帶為酶切后的pET30a質粒條帶，原pET30a大小為5 422 bp，而在633 bp處也各有一條帶，為酶切后的nox基因片段。重組質粒pET30a-nox測序結果正確率99%以上，證明該質粒構建成功。

2.1.4 pET30a-nox表達產物SDS-PAGE分析

圖4 pET300aa--nnooxx表達產物SDS-PAAGGEE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expression products of pET30a-nox

將重組的pET30a-nox轉入表達型大腸桿菌BL21誘導表達，經過蛋白電泳并染色脫色后的條帶結果如圖4所示。對誘導前泳道和誘導后泳道的對比發現，在25 kD和33 kD處的蛋白條帶均在誘導后出現了表達升高。泳道1為未誘導組，在33、25 kD處出現的條帶比較淡；泳道2為誘導組，和未誘導組相比，誘導后33、25 kD處的條帶顏色較深，說明這兩個蛋白都極有可能是實驗中誘導出來的重組蛋白。

2.1.5 Western blot鑒定結果

圖5 pET30a--nox表達產物Western bloott分析Fig. 5 Analysis of over-expressed products of pET30a-nox by Western blot

為了識別正確的Nox重組蛋白條帶，本實驗用Western blot方法進行驗證。由于pET30a-nox表達產物中加有組氨酸標簽（Histidine-tag，His-tag），所以使用抗His-tag抗體識別正確的Nox重組蛋白。如圖5所示，泳道1是沒有誘導的上清液，在33 kD處出現很細的條帶，泳道2是誘導后的上清液，在33 kD處出現目標條帶，顏色較深，寬度大，說明誘導后蛋白表達升高。與SDS-PAGE相比25 kD處無陽性條帶，說明重組蛋白Nox的分子質量約為33 kD。根據目的基因片段大小預測的蛋白分子質量約為25 kD，后來從載體pET30a圖譜上發現，除去目的基因，載體上的兩段His標簽之間還夾雜著S標簽以及其他堿基，大約7～8 kD，所以Western blot結果圖上只有約33 kD的蛋白會有陽性條帶。

2.2 nox基因的功能研究

2.2.1 過表達菌株EGDe-nox結果鑒定

圖6 PCR鑒定過表達菌株EGDe-nnooxx結果Fig. 6 Detection of EGDe-nox by PCR

利用引物pERL3-F和pERL3-R對轉化子進行PCR鑒定，為了得到更好的鑒定結果，對引物pERL3-F和pERL3-R進行了設計，雖然該對引物起始于質粒pERL3上，但是復制的序列恰好包含了連接的nox基因片段部分，結果如圖6所示。泳道1～2為EGDe陰性對照，由于內部不含質粒，無條帶出現；3～4為質粒pERL3，由于純質粒中無nox基因連接部分，所以出現的條帶僅僅是擴增質粒上的部分序列，大小約為410 bp；5～6為重組質粒pERL3-nox的陽性對照，由于擴增部分包含nox基因部分，所以條帶應比3～4條帶大，而又比3～4條帶和nox基因片段之和（1 043 bp）小，因為雙酶切部分會去掉質粒上小部分片段；而7～10為轉化子，擴增得到的條帶與6～7陽性對照大小一致，則說明重組質粒pERL3-nox已正確插入EGDe中。此鑒定結果證明過表達菌株EGDe-nox構建成功。

2.2.2 過表達菌株EGDe-nox活性氧測定結果

過表達菌株EGDe-nox活性氧測定結果如圖7所示，圖中以EGDe-pERL3為對照，將其設定為1.0。從圖中可以發現，雖然EGDe-nox在0.5 h和1 h測得的活性氧比對照菌偏高，但是僅僅偏高2.6%和2.5%，并沒有太大的變化。

圖7 7 noxnox過表達后對EGDe活性氧的影響Fig. 7 Influence of nox over-expression on ROS production in EGDe

2.2.3 nox基因的過表達對其他毒力基因表達的影響

圖8 8 noxnox基因的過表達對其他毒力基因表達的影響Fig. 8 Influence of nox over-expression on the expression of other virulent genes in EGDe

實時熒光定量PCR的結果處理都是以EGDe各相應的基因為對照為1，所以圖8中顯示的柱狀圖都是EGDe-nox中的基因的相對表達量，高于1則為表達上調，低于1則為表達下調。從圖中可以看出，nox基因過表達了接近9 倍，而因此受影響最大的是sigB和prfA，分別上調了6.5 倍和5.5 倍。sigB是單增李斯特菌對環境脅迫產生應答反應的主要調控因子[20-21]，而prfA是單增李斯特菌的毒力基因，由轉錄活化因子PrfA調控[22]。從圖中也可以發現，其余基因actA、inlA、inlB以及vip都有上調，而actA、inlA和inlB都是單增李斯特菌中和侵襲相關的基因[23-24]，因此nox基因的過表達也許會導致單增李斯特菌的侵襲能力加強。

3 討 論

通過以上研究表明，EGDe中nox基因（GenBank ID：986631）可誘導表達33 kD蛋白質，為以后純化蛋白從蛋白結構上分析該Nox蛋白與Noxs的關系奠定基礎。而從nox的過表達對ROS產生影響的實驗結果可以看出，該nox基因的過表達對Lm中ROS的產生并沒有多大影響，有可能是因為本研究使用的nox基因序列（GenBank ID：986631）單獨過表達不足以引起ROS的變化，也許該Nox蛋白不能獨立主導ROS的產量；也有可能是由于重組質粒在菌體內表達的過程中，形成包涵體，無法繼續發揮其作用。qRT-PCR的數據表明nox的過表達可以導致黏附基因inlA和inlB的表達上調，而Muchnik等[25]也發現NADH氧化酶在肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）毒性中的作用類似黏附素，說明nox基因的作用也許和Lm的毒力有關。

noxs基因在高等動植物細胞中的研究已趨于成熟，而在細菌中的研究則少之又少，目前僅在19種細菌中報道了noxs基因[11]。根據產生ROS功能的不同，noxs基因分為3 種，第1種是需氧菌中專門產生H2O2的nox1[26]；第2種是厭氧菌專門產生H2O的nox2[27]；第3種是專門產生超氧陰離子自由基（O2－·）的nox3[26]。Patchett等[17]在研究Lm（NCTC 7973）氧化代謝過程中，通過外源加入NADH方法，首次證實Lm中存在Noxs酶活性。但是已報道的19 種菌中卻不包含Lm，于是本實驗室對該19 種菌的noxs基因進行BLAST、DNAstar等軟件比對后發現，嗜熱菌（Thermus thermophilus HBB）中的nox1基因所表達的蛋白序列，在L型菌株EGDe中存在高度相似性氨基酸序列。

本實驗中所使用的序列正是從EGDe基因組中找到的疑似nox1基因序列（GenBank ID：986631），但是經過同源性對比，發現其和高等動植物的nox1基因同源性較低。至2015年8月，NCBI已公布8 種來自Lm不同血清型的NADH氧化酶序列，但不知這8 種序列在Lm上產生的作用是否和高等動植物的NADH氧化酶一樣，也不知不同血清型之間，nox基因有什么區別和聯系。本實驗使用的來自EGDe的基因序列（Gene ID：986631），但實驗結果顯示該基因和ROS產生沒有明顯相關性，而且該基因大小與NADH氧化酶的關鍵亞基gp91phox的編碼基因的大小并不一致，也許其是編碼其他亞基的基因，在ROS方面的功能并不突出，但卻足以引起其他毒力基因表達水平的改變。至于剩余的7 種來自Lm不同血清型的NADH氧化酶序列及功能，尚需繼續探索。

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Gene Cloning, Expression and Functional Charaterization of NAD(P)H Oxidases Gene (nox) from Listeria monoeytogenes

WU Man1, LI Sen1, CHEN Guowei1, LUO Qin2, LIU Wukang1, DING Chengchao1, DONG Qingli1, LIU Qing1,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. College of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, China)

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases (Nox) is ubiquitous in higher animals and plants, and it is responsible for generating reactive oxygen species (ROS). The aim of this work was to explore whether the NOX mediates the generation of ROS in Listeria monocytogenes (Lm). The nox gene from the wild-type Listeria monocytogenes EGDe (GenBank ID: 986631) was tested. The gene was induced to express Nox in Escherichia coli BL21 and the molecular weight of the expressed enzyme was measured by using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot. Then the over-expressed strain EGDe-nox was built to detect ROS production and examine the influence of nox gene over-expression on the expression of virulence genes by using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-qPCR). The results showed that the molecular weight of the recombinant Nox was about 33 kD. Compared with EGDe, the ROS production of EGDe-nox was not changed significantly. The over-expression of nox resulted in up-regulated expression of the invasion-related genes actA, inlA and inlB and the virulence gene prfA. These results suggest that the Nox is unable to dominate ROS production independently but its over-expression can up-regulate the expression of virulence genes.

Listeria monocytogenes; NADH oxidase; nox; reactive oxygen species (ROS)

10.7506/spkx1002-6630-201702008

Q935

A

1002-6630（2017）02-0046-06

吳嫚, 李森, 陳國薇, 等. 單增李斯特菌nox基因的克隆、表達以及功能[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 46-51. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702008. http://www.spkx.net.cn

WU Man, LI Sen, CHEN Guowei, et al. Gene cloning, expression and functional charaterization of NAD(P)H oxidases gene (nox) from Listeria monoeytogenes[J]. Food Science, 2017, 38(2): 46-51. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201702008. http://www.spkx.net.cn

2016-03-18

國家自然科學基金面上項目（31371776）

吳嫚（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食源性致病菌致病機理。E-mail：mandy_wu1247@163.com

*通信作者：劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機理、疫苗及快速檢測技術。E-mail：liuq@usst.edu.cn