熏煮火腿中志賀氏菌的熱失活特性

張佩佩，李苗云*，趙改名，崔文明，高曉平，柳艷霞，趙莉君，王亞飛

熏煮火腿中志賀氏菌的熱失活特性

張佩佩，李苗云*，趙改名，崔文明，高曉平，柳艷霞，趙莉君，王亞飛

（河南農業大學食品科學技術學院，河南省肉制品加工與質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002）

為了研究志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中熱失活規律，以55、63 ℃對接種108CFU/g志賀氏菌的熏煮火腿進行熱處理，測定處理后樣品中志賀氏菌的殘存菌體濃度。應用Logistic模型和3rd degree polynomial模型擬合在兩種溫度下志賀氏菌的動力學模型，用D值（decimal reduction time）表示志賀氏菌在熏煮火腿中的耐熱情況。結果表明：11 株志賀氏菌的熱失活曲線運用3rd degree polynomial擬合較好，相關系數均在0.98以上。志賀氏菌不同菌株的D值不同，55 ℃條件下志賀氏菌在熏煮火腿中的D值為4.46～10.66 min，63 ℃條件下D值為0.48～3.22 min。不同菌株之間抗熱性存在差異，其中菌株S-5的耐熱性最強，S-6最弱。

志賀氏菌；熏煮火腿；熱失活；動力學模型；D值

志賀氏菌（Shigella）是一種不形成芽孢的革蘭氏陰性、兼性厭氧桿菌，是腸桿菌科感染的病原菌之一[1]。它能夠通過侵襲大腸引起患者典型菌痢癥狀，如發熱、腹痛、腹瀉等[2]。據統計，2005年全球的人類痢疾病例有8 000萬例，導致約70萬人死亡[3]。志賀氏菌屬在我國感染性腹瀉病原菌中居首位，志賀氏菌主要由食用未烹調的食物引起，如含碳水化合物和蛋白的沙拉[4]。熏煮火腿是以生鮮豬肉或者雞肉為原料，常壓下經蒸煮和熏烤的火腿類熟肉制品。它屬于低溫肉制品的范疇，以營養豐富、易消化吸收、食用方便、風味獨特以及便于攜帶和保存而深受廣大消費者的青睞[5]。食品殺菌的方法很多，包括物理、化學和生物法等。熱處理是商業應用的標準滅活方式，它是食品工業最經濟有效、最簡便和使用最廣泛的殺菌方法[6]。在微生物殺菌研究中，預測微生物學結合化學、微生物學、統計學、數學以及計算機技術研究和建立不同環境因素影響下的失活參數模型，能夠快速評估微生物殘存情況,避免了傳統方法的繁瑣和滯后性，已獲得了廣泛的應用[7-8]。

細菌菌株之間存在耐熱性差異，其熱失活曲線并不嚴謹遵循對數線性關系，在擬合細菌熱失活規律時，經常出現細菌對數圖凸形、凹形以及S形曲線等一系列非線性的現象[9-12]。多項式擬合模型已經在生物學、醫學、衛生學等諸多領域都具有廣泛的應用[13]，董慶利等[14]將此模型應用于失活模型，發現可以很好地擬合氣單胞菌的失活曲線。目前，有關單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等食源性致病菌的熱失活的研究已有報道[15-17]，而有關志賀氏菌熱失活方面的研究鮮見報道，為了達到消毒且不損害食品品質的目的，工業上常用的滅菌方法是巴氏殺菌（溫度一般在60～82 ℃），但是巴氏殺菌熱處理程度比較低，殺菌后容易造成微生物的殘存。本實驗研究了2 種溫度熱處理對熏煮火腿中志賀氏菌不同菌株的影響，用3rd degree polynomial擬合熏煮火腿中志賀氏菌不同菌株的非線性失活曲線，建立了熏煮火腿中志賀氏菌不同菌株的熱失活模型，用D值（decimal reduction time）比較了志賀氏菌在熏煮火腿中的耐熱性情況，為熏煮火腿中志賀氏菌的控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熏煮火腿 河南漯河雙匯集團。

11 株志賀氏菌，均為河南省肉制品加工與質量安全控制重點實驗室從肉中分離并經過國標法生化鑒定、Vitek測定以及分子鑒定，－80 ℃甘油管保存。

營養肉湯（nutrient broth，NB）、營養瓊脂（nutrient agar，NA）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（xylose lysine deoxycholate salt agar，XLD） 青島高科園海博生物技術有限公司；氯化鈉（分析純） 天津市瑞金特化學品有限公司。

一次性無菌培養皿 江蘇省泰州市利康醫療器械有限公司。

1.2 儀器與設備

HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司；拍打式均質器 法國AES Chemunex公司；SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣計數有限公司；真空包裝機溫州市大江真空包裝機械有限公司；JA2003N電子天平上海菁海儀器有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養箱、精密鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-501數顯超級恒溫水浴 金壇市杰瑞爾電器有限公司；THZ-C臺式恒溫振蕩器 太倉市華美生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品準備

取同一生產日期的熏煮火腿，紫外線照射30 min后去除外皮，無菌條件下將其絞碎，以每份（25±0.5） g進行真空封裝。－25 ℃條件下保存，使用前置于4 ℃條件下解凍。

1.3.2 菌懸液的制備

無菌操作條件下，將儲存于－80 ℃條件下的志賀氏菌接種到NA平板上，37 ℃條件下培養24 h，挑取典型菌落至無菌的NB培養基中，37 ℃、150 r/min搖床培養至穩定期（菌體濃度約109CFU/mL）。得到的穩定期菌液稀釋至108CFU/mL備用。

1.3.3 人工污染介質熏煮火腿

[18]的方法，無菌操作取2.5 mL 1.3.2節制備的菌懸液，置于1.3.1節無菌真空袋樣品中并壓成均勻片狀，用真空包裝機0.1 MPa抽真空，并封口并使其袋子厚度小于1 mm，以確保傳熱的統一。放在（37±1） ℃的恒溫培養箱培養18 h后備用。每一組溫度時間的組合重復3 次。

1.3.4 熱處理

表1 熱處理溫度、時間及時間間隔Table1 Temperature, time and time intervals of heat treatments

接種后的樣品放置在預熱的恒溫循環水浴鍋中進行熱處理，水浴鍋的設定溫度分別為55、63 ℃，加熱時間0.5～80 min（表1）。加熱時將樣品完全浸沒熱水中，按照預先設定的時間間隔，定時取出樣品進行測定。熱處理后的樣品應立即放入預先準備好的冰水中，以阻止其繼續進行熱失活過程。從設定溫度冷卻至室溫的時間小于10 s。

1.3.5 志賀氏菌計數

將熱處理后的樣品在潔凈無菌的環境條件下，加入225 mL 0.85%無菌NaCl溶液，在均質器中拍打2 min，使之與樣品混合均勻，獲得1∶10（m/V）的懸浮液。拍打后進行梯度稀釋，將樣品原液或梯度稀釋液涂布在剛配置的XLD培養基上。然后，放至37 ℃恒溫培養箱培養，48 h后計數志賀氏菌菌落數目，計算菌體濃度。

1.3.6 熱失活模型建立及模型驗證

熱失活模型利用CurveExpert軟件建立Logistic模型（式（1））和3rd degree polynomial模型（式（2））擬合，選擇最合適的模型得出志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中熱失活曲線，并得到相應的模型參數。

式中：y為志賀氏菌的殘存菌體濃度（lg（CFU/g））；x為熱處理時間/min；A1、A2、x0、p、a、b、c、d為模型參數。

應用建立的志賀氏菌的熱失活動力學模型求得72 ℃條件下的預測值，與在72 ℃條件下熱失活實驗中試劑檢測的志賀氏菌數量進行比較，采用準確度（Af）和偏差度（Bf）來評價所建模型的可靠性[19]，分別按式（3）和（4）計算。

式中：N實測為試驗實際測得的志賀氏菌菌體濃度（lg（CFU/g））；N預測為應用熱失活模型預測得到的同一時間點的志賀氏菌菌體濃度（lg（CFU/g））；n為實驗次數。

1.3.7 D值的計算

D值是指在某一溫度下，活菌數死亡90%所需要的時間，即細菌殘存曲線經一個對數周期所需的時間。D值是細菌死亡率的倒數，D值越大死亡速率越小，該菌的耐熱性越強。用Linear模型擬合熱致死曲線式中，t為熱處理時間，x表示加熱時間，y表示細菌活細胞的對數值，可得出該函數的斜率（k）的負倒數為所求的D值，即D＝－1/k。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0軟件進行數據處理與統計分析，所有數據均為3 個平行樣品分別測定3 次的平均數，數據均以±s表示。

2 結果與分析

2.1 志賀氏菌在熏煮火腿中的熱失活效果

圖1 志賀氏菌不同菌株熏煮火腿中的熱失活曲線Fig. 1 Survival curves of different Shigella strains in smoked cooked ham

為了研究志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的熱失活情況，本實驗選擇了55 ℃和63 ℃ 2 個溫度熱處理熏煮火腿。如圖1所示，志賀氏菌不同菌株的熱失活情況有所不同，但是樣品進行熱處理4 min時，志賀氏菌的熱殺菌效果顯著，這與志賀氏菌剛進入熱刺激環境不適應有關，隨著熱處理時間的延長，殘菌量慢慢減少直至全部死亡。

2.2 志賀氏菌在熏煮火腿中熱失活模型的選擇

表2 志賀氏菌不同菌株的3rd degree polynomial型和Logistic模型在兩種溫度下的相關系數Table2 Correlation coefficients of the 3rd degree polynomial model and the logistic model for differentShiggeellllaa strains at two temperatures

志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿的3rd degree polynomial模型在不同溫度條件下的擬合很好，相關系數均在0.98以上；Logistic模型擬合也較好，相關系數均在0.88以上。由表2可知，志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的熱失活情況用3rd degree polynomial模型描述比Logistic模型擬合相關性更好，因此選用了3rd degree polynomial模型建立熱失活模型。

圖2 多項式擬合志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的熱失活規律Fig. 2 Survival curves of different Shigella strains in the smoked cooked ham at 55 and 63 ℃ as modeled by regression for 3rd degree polynomial fitting models

將22 組實驗數據進行3rd degree polynomial模型擬合，擬合的熱失活曲線如圖2所示。通常來說，殘存菌體濃度的對數值隨著加熱時間的延長而減少。同時，細菌死亡速率隨著溫度的升高加快，溫度越高，殺死細菌所需的時間越短。由圖2可知，熱失活曲線并不是直線，而是普遍向下凹，這說明隨著加熱時間的延長，志賀氏菌失活速率也跟著加快。此外從圖2還可看出，早期志賀氏菌菌體濃度變化不明顯，當加熱時間超過一定閾值時，志賀氏菌的失活速率才隨時間變化開始加快。這說明志賀氏菌的菌體濃度在剛開始加熱時并沒有馬上減少，這種現象可能與樣品的形狀大小有關[20]。在初始加熱時間，溫度對于中心位置存在的志賀氏菌并沒有很大影響。而且本實驗的進行過程中已經盡量地減少樣品的厚度（＜1 mm），且在較低溫度條件下（55 ℃和63 ℃），樣品檢測時間明顯高于升溫時間。所以本實驗結果中出現“肩效應”可能是由于在明顯觀察到熱致死效應前，加熱過程需要克服一些起初的能量障礙，志賀氏菌做出一定的抵抗，而在熱傳遞過程中會引發一些生化反應[11]。

2.3 志賀氏菌熱失活模型的驗證

為了定量評價建立的3rd degree polynomial模型的可靠性，本實驗采用了Ross提出的并且已經被許多學者所接受的準確度和偏差度[21]。Af是用來衡量預測值和實測值之間的差異，Bf是用來檢查預測值上下波動的幅度。在72 ℃條件下隨機選擇2 株志賀氏菌在熏煮火腿中存活的真實值與應用預測模型計算得到的志賀氏菌存活的預測值來計算準確度和偏差度，以比較、評價和驗證模型的可靠性（表3）。

表3 72℃條件下熏煮火腿中志賀氏菌失活預測值的準確度和偏差度Table3 Accuracy and bias factor of the predicted values of Shiggeellllaa strains in the smoked cooked ham exposed to 72 ℃

由表3可知，本研究中預測值和實測值之間的Af在1.166～1.172之間，預測值上下波動的Bf為10%左右。驗證結果表明，本研究中建立的志賀氏菌的熱失活模型能很好的預測不同溫度處理對志賀氏菌的影響。

2.4 志賀氏菌在熏煮火腿中耐熱性分析

表4 志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的耐熱性Table4 Heat resistance (expressed as D-values in min) forr Shiggeellllaa strains in the smoked cooked ham at 55 and 63 ℃

細菌的耐熱性常以D值來表示，由表4可知，在熏煮火腿中，55 ℃條件下D值為4.46～10.66 min，63 ℃條件下D值為0.48～3.22 min。志賀氏菌不同菌株D值不同，其中菌株S-5的D值最大，S-6的最小。說明不同來源的耐熱能力是有所差異的，這和其他學者報道的結果是一致的。Osaili等[22]報道的甲型副傷寒沙門氏菌在雞肉制品中的D60℃為0.46 min，Bucher等[23]報道的腸炎沙門氏菌在雞肉制品中的D60℃為0.39 min，而Juneja等[24]報道的湯普森氏沙門氏菌在雞胸肉中的D60℃為5.20 min。不同血清同一菌屬的細菌內部結構有所差異，從而導致他們對刺激環境的適應能力不同。S-5在11 株志賀氏菌中耐熱能力較強可能是由于其本身含有耐熱基因rpoS、rpoE、rpoH或者含有耐熱蛋白，當菌株S-5受到熱刺激時，導致這些耐熱基因的激活發揮抵抗作用[25]。此外，細菌所在的介質會影響其耐熱性，實驗中用的熏煮火腿盡量保持同一批，但是因生產等原因不可能保證所含的營養成分完全一致。熏煮火腿中含有的蛋白質對細菌具有緩沖作用，同時也會加速細菌的自我修復和生長繁殖[26]。脂肪的導熱性差，水分活度低使脂肪同樣具有緩沖保護作用[27]，高脂肪含量的熏煮火腿導致志賀氏菌更高的耐熱性。

3 結 論

本實驗應用多項式模型擬合了志賀氏菌不同菌株在熏煮火腿中的熱失活曲線，相關系數均在0.989～0.999，并用72 ℃條件下實際的志賀氏菌存活數對模型進行驗證，得到預測值和實測值之間的Af在1.166～1.172之間，預測值上下波動的Bf為10%左右，表明多項式模型能很好的預測不同溫度處理對志賀氏菌的熱失活動態。采用D值比較了志賀氏菌在熏煮火腿中的耐熱性情況，結果表明志賀氏菌不同菌株的耐熱性存在差異，菌株S-5耐熱性最強。本研究結果為熱處理殺滅熏煮火腿中志賀氏菌提供理論參考，同時為進一步研究志賀氏菌的熱失活機制提供了參考依據。

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Thermal Inactivation Properties of Shigella in Smoked Cooked Ham

ZHANG Peipei, LI Miaoyun*, ZHAO Gaiming, CUI Wenming, GAO Xiaoping, LIU Yanxia, ZHAO Lijun, WANG Yafei
(Henan Key Laboratory of Meat Processing and Quality Safety Control, College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

This study aimed to examine the thermal inactivation pattern of Shigella in smoked cooked ham. Shigella (108CFU/g) were inoculated into smoked cooked ham, cultured at constant temperature and constant humidity and then subjected to thermal treatment at 55 or 63 ℃. The number of surviving cells was counted on selective media. A Logistic model and a 3rd degree polynomial model were separately used to fit the thermal inactivation curve by CurveExpert software. Decimal reduction time (D values) represented the heat resistance of Shigella. The results showed that the curves for 11 Shigella strains f tted by the 3rd degree polynomial model were better, with correlation coeff cients (R2) above 0.98. The D values of different Shigella strains were different, ranging from 4.46 to 10.66 min at 55 ℃ and from 0.48 to 3.22 min at 63 ℃ in the inoculated smoked cooked ham. The heat resistance of different Shigella strains were different, and strain S-5 had the strongest heat resistance while S-6 was the weakest.

Shigella; smoked cooked ham; thermal inactivation; kinetic model; decimal reduction time (D value)

10.7506/spkx1002-6630-201702007

TS251.5

A

1002-6630（2017）02-0040-06

張佩佩, 李苗云, 趙改名, 等. 熏煮火腿中志賀氏菌的熱失活特性[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 40-45. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702007. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Peipei, LI Miaoyun, ZHAO Gaiming, et al. Thermal inactivation properties of Shigella in smoked cooked ham[J]. Food Science, 2017, 38(2): 40-45. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702007. http://www.spkx.net.cn

2016-03-02

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401511）

張佩佩（1991—），女，碩士研究生，研究方向為肉品安全與質量控制。E-mail：zhangpeipeii@163.com

*通信作者：李苗云（1976—），女，教授，博士，研究方向為肉品安全與質量控制。E-mail：limy7476@126.com