傳統發酵錦州小菜中主要微生物多樣性分析

孫慧君，張 穎，王洪玉，楊 梅，岳喜慶，烏日娜,4,*

傳統發酵錦州小菜中主要微生物多樣性分析

孫慧君1,2，張 穎1，王洪玉3，楊 梅1，岳喜慶1，烏日娜1,4,*

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧省農業經濟學校現代農業技術系，遼寧 錦州 121001；3.沈陽農業大學園藝學院，遼寧 沈陽 110866；4.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，食品學院，江蘇 無錫 214122）

通過探究錦州小菜的微生物群落組成，以期為改善其品質提供依據。利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳對采集自10 份錦州地區傳統發酵小菜中的微生物多樣性進行研究，結果表明：共鑒定出5 種細菌，分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、Lactobacillus fabifermentans、希臘魏斯菌單菌（Weissella hellenica）、假單細胞菌（Psychromonas arctica）；真菌菌屬有3 種，分別為熱帶假絲酵母（Candiada tropicalis）、彎曲黏膜菌（Campylobacter mucosalis）、白色念珠菌（Candida albicans）。其中，主要細菌為植物乳桿菌、食竇魏斯氏菌，主要真菌為熱帶假絲酵母。

錦州小菜；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳；多樣性

我國傳統發酵食品有著悠久的歷史，且有各自獨特的生產工藝，發酵過程涉及微生物種類較多，賦予食品特有的風味[1]。錦州小菜是遼寧錦州市特色的傳統發酵食品，創始于清朝初年，距今已有三百多年的歷史[2-3]，為人們熟知的腌菜如蝦油類的蝦油黃瓜、什錦菜、蝦醬菜，鹽漬類的鹽漬豇豆等等。傳統的錦州小菜采用黃瓜、圓青椒、小茄子、豇豆等新鮮蔬菜經食鹽、醬油、食醋、糖等調料腌制而成，因當地的獨特氣候及水質使醬菜具有特殊風味。制作出來的小菜質地脆嫩，味道可口，受到許多人們的喜愛。傳統發酵食品由于微生物的發酵作用經過分解、消除和過濾過程后更具有安全性[4]。食用這些發酵蔬菜除可提高營養利用外[5]，同時還可以攝入乳酸菌及其代謝產生的有機酸等，可以促進宿主腸道內菌群生態平衡、防止細胞老化、降低膽固醇，對人體代謝產生有益的調節作用[6-7]。

20世紀初，人們對發酵蔬菜中微生物進行研究發現，乳酸菌及酵母菌等益生菌對發酵蔬菜中的風味及質地起到至關重要的作用[8]。在國內利用益生菌發酵的泡菜產品酸鮮可口，營養豐富，天然風味濃郁，具有良好的保健功能，富含益生菌和天然植物化學物[9]。發酵蔬菜中的主要微生物有：植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、乳酸乳球菌、魏斯氏菌、酵母菌（主要為釀酒酵母、漢遜得巴利酵母、熱帶假絲酵母）等。而國外的發酵食品多為發酵奶類及肉制品，其中的主要微生物為糞腸球菌、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳酸桿菌、長雙岐桿菌和分叉雙歧桿菌等[10]。

變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等[11]于20世紀80年代初期發明的。Muyzer等在1993年首次將其應用于微生物群落結構研究，并證實了這種技術在揭示自然界微生物領域的遺傳多樣性和菌群差異方面具有獨特的優越性，目前已經發展成為研究微生物群落結構的主要分子生物學方法之一[12-13]。與傳統分離培養的方法相比，DGGE技術可以反映微生物群體結構的原始狀態，可以比較不同的發酵樣品，進而探究發酵食品中微生物的變化規律[14]。

錦州小菜風味獨特，其中賦予小菜風味的菌種有待于進一步去探究開發，而目前相關研究甚少。本實驗采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）結合DGGE方法對10 種傳統發酵錦州小菜中微生物多樣性進行初步探究，為改善其品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取常見的錦州傳統發酵制作的特色小菜作為研究材料，樣品自同一日上午采集于遼寧錦州市內3 區的5 個地點。采集地點及樣品編號為：古塔區石橋子早市咸芥菜絲（ZS1）、紅芥菜絲（ZS2）、早市蝦油黃瓜（ZS3）、腌蒜（ZS4）；古塔區大潤發超市蝦油黃瓜（DRF1）、辣蘿卜（DRF2）、凌河區金城農貿市場辣白菜（JL1）、辣蘿卜（JL2）、凌河區城市生活廣場辣白菜（CS1）、太和區華聯超市白醋蒜（HL1）。將其發酵液存入滅菌的離心管中封口，平行采集3 份。樣品采集的同時記錄采集溫度、發酵時間并做好標識。樣品用液氮處理后保存于－80 ℃冷庫。

1.2 試劑

聚丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、四甲基乙二胺 北京艾徳萊生物有限公司；磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鉀、氯化鈉、10×TE緩沖液、1×TAE電泳緩沖液、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）、乙酸鈉、異丙醇、冰醋酸、乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖 北京沃比森科技有限公司；液氮 沈陽嘉和氣體有限公司；蛋白酶K、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP）、10×PCR buffer、r-Taq酶、Loading buffer、Marker DM2000、Gel-red核酸染料、引物 北京艾比根生物有限公司。

1.3 儀器與設備

PL303/01電子天平 上海卓精電子科技有限公司；GMSX-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 北京永光明醫療儀器有限公司；SH2100 pH計 奧豪斯儀器（常州）有限公司；ZHJH-C1112C無菌操作臺 北京瑞爾欣德科技有限公司；DHG-9070S電熱鼓風干燥箱、電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司；VS-1渦旋儀 北京中時維興儀器設備公司；CR-21G離心機 日本日立公司；TDL-SA離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；超低溫冰箱、TGL-168高速臺式離心機、5810高速冷凍離心機、微量紫外-分光光度計 德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；PCR擴增儀、凝膠成像系統、DGGE儀 美國伯樂公司。

1.4 方法

1.4.1 發酵液的處理

取20 mL發酵液，12 000 r/min離心15 min，棄去上清液，加入10 mL滅菌水清洗沉淀，重復多次，直至上清液清澈。在沉淀中加入700 μL TE緩沖液回溶，用于總DNA提取。

1.4.2 發酵小菜的處理

取20 g樣品小菜搗碎，用30 mL PBS緩沖液4 ℃浸提過夜[15]。之后操作同1.4.1節。

1.4.3 樣品的總DNA提取

采用CTAB法對總DNA的進行提取[16]，每份樣品提取3 次。用微量紫外-分光光度計測定DNA質量濃度和A260nm/A280nm（表示所提取DNA的純度），將A260nm/A280nm在1.8～2.2范圍內的DNA樣品進行下一步PCR擴增。

1.4.4 PCR擴增

1.4.4.1 細菌DNA的PCR擴增

以提取的總DNA為模板，采用16S rDNA基因V3區具有特異性的引物（V3F＋GC：5’-CGCCC GCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和V3R：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）進行16S rDNA的PCR擴增，擴增產物片段長約250 bp。擴增反應體系（50 μL）包括：1.5 μL DNA模板、5.0 μL 10×PCR buffer、4.0 μL dNTP、上游引物1.5 μL、下游引物1.5 μL、DNA Taq酶0.5 μL、36 μL超純水。反應參數：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環30 次；72 ℃延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.4.2 真菌DNA的PCR擴增

以提取的總DNA為模板，采用26SrDNA D1/D2區具有特異性的引物（正向引物：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，反向引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行26S rDNA的PCR擴增[17]，擴增產物片段長約600 bp[18]。擴增反應體系（50 μL）包括：5.0 μL DNA模板、5.0 μL buffer、4.0 μL dNTP、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL，剩余體系用超純水混勻。反應參數：95 ℃預變性5 min； 94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環36 次；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃條件下保存。

1.4.5 DGGE

細菌的變性劑濃度范圍為35%～50%[19]，在150 V電壓、60 ℃條件下電泳7 h，真菌的變性劑濃度范圍為35%～50%，在120 V電壓下，60 ℃電泳5.25 h。電泳完畢后，利用Gel-red染色法對凝膠進行染色。將染好的凝膠用掃描儀成像，得到PCR-DGGE圖譜，對掃描后的圖片進行標注分析，并標注特異性條帶，回收條帶。

1.4.6 DGGE膠條回收測序

用刀片在酒精燈外延加熱滅菌后切割膠條，將膠條放入1.5 mL離心管中，并做好標記。向其中加入100 μL去離子水沖洗膠條（3～4 次），棄去洗水后，再用100 μL超純水溶解膠條中的DNA，4 ℃條件下靜置約12 h。將充分溶解的DNA樣品進行PCR檢驗。其中，細菌回收DNA擴增反應體系（50 μL）包括：5.0 μL回收DNA模板、5.0 μL 10×PCR buffer、4.0 μL dNTP、上游引物（F338）1.5 μL、下游引物1.5 μL、DNA Taq酶0.5 μL、超純水32.5 μL，反應參數同1.4.4.1節。真菌回收DNA擴增反應體系，反應參數同1.4.4.2節。測序由上海派森諾生物公司完成。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

由表1可知，10 種樣品的DNA質量濃度在均100 ng/μL以上，同時這些樣品DNA的A260nm/A280nm值基本保持在1.8～2.2的范圍內，可進行PCR擴增。

表1 錦州小菜提取總DNA結果Table1 Extraction of total DNA from Jinzhou pickles

2.2 PCR擴增結果

圖1 細菌（a）及部分真菌（b）PCR擴增結果Fig. 1 PCR amplification results of total DNA extracted from the bacterial (a) and fungal (b) strains

分別以提取的細菌和真菌總DNA做模板，進行PCR擴增，然后采用1%瓊脂糖凝膠電泳對其產物進行檢測。所擴增的產物分別在250 bp（圖1a）和600 bp（圖1b）左右處有明顯條帶，說明PCR擴增成功，可以進行DGGE。

2.3 DGGE檢測結果

2.3.1 細菌多樣性檢測結果

表2 錦州小菜樣品細菌16S rDNA V3區PCR-DGGE特異性條帶比對結果Table2 Sequence alignment of PCR-DGGE specific bands of bacterial 16S rDNA V3 regions from samples

圖2 錦州小菜樣品細菌的PCR-DGGE圖譜Fig. 2 PCR-DGGE profiles of bacterial populations from each pickle sample

采用CTAB法提取傳統發酵小菜樣品的總DNA，通過特異性擴增細菌16SrDNA V3區，其PCR-DGGE圖譜如圖2所示。錦州小菜細菌DNA的PCR-DGGE圖譜中共找到5 條特異性條帶，對其編號切割、回收測序，并登錄NCBI數據庫進行BLAST同源性對比分析（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

由圖2、表2可知，條帶A鑒定結果為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），共有7 份樣品（ZS3、HL1、ZS2、ZS4、ZS1、JL2、DRF2）檢測到該條帶；條帶B為一種假單細胞菌（Psychromonas arctica），共有1 份樣品（JL1）檢測到該條帶；條帶C為食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），有6 份樣品（ZS3、ZS2、DRF1、ZS1、JL1、CS1）檢測到該條帶；條帶D為Lactobacillus fabifermentans，共有2 份樣品（ZS3、ZS2）檢測到該條帶；條帶E為希臘魏斯氏菌（Weissella hellenica），共有3 份樣品（DRF1、JL1、CS1）檢測到該條帶。推測細菌植物乳桿菌、食竇魏斯氏菌可能為傳統發酵錦州小菜中的優勢菌群。

魏斯氏菌主要存在于泡菜、發酵食品等，并在發酵初期成為主要優勢菌群，而在后期發酵中被乳酸桿菌等代替[20]。Lee等[21]探究了人糞便中分離的8 種魏斯氏菌的益生屬性，初步驗證了食竇魏斯氏菌等對低pH值、6.5%低鹽濃度和0.3%膽鹽有一定的耐受性，對卡那霉素、鏈霉素有一定的耐藥性；相比于黏附性較好的鼠里糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus），食竇魏斯氏菌等對Caco-2細胞模型具有更好的吸附能力等益生屬性。Sang等[22]發現魏斯氏菌在泡菜的發酵過程中其菌落數量會因添加胡椒粉而增加，而明串珠菌和乳桿菌則會有所降低。2009年，Bruyne等[23]在發酵的加納可可豆堆中分離到2 種新菌株Lactobacillus fabifermentans sp.和Lactobacillus cacaonum sp.，并通過16S rDNA基因測序證明Lactobacillus fabifermentans是植物乳桿菌的一種；Treu等[24]在自然發酵的葡萄渣中分離到了Lactobacillus fabifermentans T30PCM01，表明這類乳桿菌可能具有潛在的碳水化合物利用及轉錄調節功能。

此外，在東北特色發酵食品酸菜中，也分離得到大量菌株。烏日娜等[25]在東北自然發酵酸菜中通過PCRDGGE分離到了明串珠菌屬（Leuconostoc）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單細胞菌屬（Pseudomonas）等乳酸菌菌屬；叢敏等[26]從酸菜的前期階段分離到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）；楊洪巖等[27]對酸菜發酵中細菌的動態變化分析發現，彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）為發酵中的優勢菌群；曹碧璇等[28]利用16S rRNA基因克隆文庫分析自然發酵酸菜中片球菌屬（Pediococcuss）和枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）等亦是特色發酵食品中的優勢菌屬，但在本實驗并未分離到。本實驗分離到的2 種魏斯氏菌和Lactobacillus fabifermentans可以在以后的實驗中繼續探究。

2.3.2 真菌多樣性檢測結果

圖3 錦州小菜樣品真菌的PCR-DGGE圖譜Fig. 3 PCR-DGGE profiles of fungal populations from each pickle sample

表3 錦州小菜樣品真菌26SrDNAD1/D2區PCR--DDGGGGEE特異性條帶比對結果Table3 Sequence alignment of specific bands obtained by PCR-DGGE of fungal 26S rDNA D1/D2 regions from samples

采用CTAB法提取小菜樣品的總DNA，通過特異性擴增真菌26S rDNA D1/D2區，其PCR-DGGE圖譜如圖3所示。傳統發酵錦州小菜真菌DNA的PCR-DGGE圖譜中共找到9 條特異性條帶，對其編號切割、回收測序，并登錄NCBI數據庫進行BLAST同源性對比分析（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

由圖3、表3可知，條帶A鑒定結果為熱帶假絲酵母（Candiada tropicalis），共有5 份樣品（JL1、CS1、ZS3、ZS1、ZS2）檢測到該條帶；條帶B為彎曲黏膜菌（Campylobacter mucosalis strain），有4 份樣品（JL1、CS1、DRF2、HL1）檢測到該條帶；條帶I為白色念珠菌（Candida albicans），共有1 份樣品（ZS2）檢測到該條帶。條帶C、D、E、F、G、H未鑒定出結果，10號樣品沒有檢測到特異性條帶。推測熱帶假絲酵母可能為傳統發酵錦州小菜中的優勢菌群。

東北傳統發酵酸菜中的主要真菌菌群有漢遜得巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、擴展青霉菌（Penicillium expansum）等[16]；除此之外，武俊瑞[18]通過PCRDGGE從傳統發酵豆醬中還分離到了二孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）、近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、黏質紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、涎沫假絲酵母（Candida zelanoides）等真菌；田甜[29]從東北傳統發酵豆醬中分離到了赤霉菌屬（Gibberella）、擬青霉菌屬（Paecilomyces）、青霉菌屬（Penicillium）等真菌。

3 結 論

采用CTAB法提取總DNA，通過PCR-DGGE方法對10 份傳統發酵錦州小菜中微生物的多樣性進行分析，對其中可能富含的優勢菌群組成進行初步研究。結果發現，傳統發酵錦州小菜中的微生物豐富多樣：傳統發酵錦州小菜中可能存在的優勢菌有植物乳桿菌、魏斯氏菌、熱帶假絲酵母。其中，7 份樣品檢測到植物乳桿菌；6 份樣品檢測到食竇魏斯氏菌；共有3 份檢測到希臘魏斯氏菌；2 份樣品檢測到Lactobacillus fabifermentans；此外，1 份樣品檢測到假單細胞菌；5 份樣品檢測到熱帶假絲酵母；4 份樣品檢測到彎曲黏膜菌；1 份樣品檢測到白色念珠菌。通過對傳統發酵錦州小菜中微生物多樣性的研究，以期為錦州小菜的品質提供依據。

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Microbial Diversity of Traditional Fermented Jinzhou Pickles

SUN Huijun1,2, ZHANG Ying1, WANG Hongyu3, YANG Mei1, YUE Xiqing1, WU Rina1,4,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. College of Morden Agricultural Technology, Liaoning Agricultural Economic School, Jinzhou 121001, China; 3. College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 4. State Key Laboratory of Food Science and Technology, College of Food Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to improving the quality of Jinzhou pickles, this experiment studied the microbial community composition of Jinzhou pickles. Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) was adopted to analyze the microbial diversity of ten traditional pickle samples in Jinzhou area, Liaoning province. The results showed that f ve bacterial strains were identif ed namely Lactobacillus plantarum, Weissella cibaria, Lactobacillus fabifermentans, Weissella hellenic and Psychromonas arctica as well as three fungal species i.e., Candiada tropicalis, Campylobacter mucosalis and Candida albicans. The predominant bacteria were Lactobacillus plantarum, Weissella cibaria and the predominant fungus was Candiada tropicalis.

Jinzhou pickles; polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE); diversity

10.7506/spkx1002-6630-201702003

Q93

A

1002-6630（2017）02-0015-05

孫慧君, 張穎, 王洪玉, 等. 傳統發酵錦州小菜中主要微生物多樣性分析[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 15-19. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702003. http://www.spkx.net.cn

SUN Huijun, ZHANG Ying, WANG Hongyu, et al. Microbial diversity of traditional fermented Jinzhou pickles[J]. Food Science, 2017, 38(2): 15-19. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702003. http://www.spkx.net.cn

2016-06-27

國家自然科學基金面上項目（31471713）；中國博士后科學基金項目（2014M560395）；遼寧省農業領域青年科技創新人才培養計劃項目（2014048）；遼寧省高等學校優秀人才支持計劃項目（LR2015059）；江蘇省博士后科研資助計劃項目（1402071C）

孫慧君（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：jun_sh666@163.com

*通信作者：烏日娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wrn6956@163.com