葡萄皮和葡萄酒抗氧化活性與抑制斑馬魚血管生成研究

孫海燕 王 華 徐志民 李 華

(1.西北農林科技大學食品科學與工程學院， 陜西楊凌 712100； 2.陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室， 漢中 723000；3.西北農林科技大學葡萄酒學院， 陜西楊凌 712100； 4.路易斯安那州立大學食品科學系， 巴吞魯日 70803)

葡萄皮和葡萄酒抗氧化活性與抑制斑馬魚血管生成研究

孫海燕1,2王 華3徐志民4李 華3

(1.西北農林科技大學食品科學與工程學院， 陜西楊凌 712100； 2.陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室， 漢中 723000；3.西北農林科技大學葡萄酒學院， 陜西楊凌 712100； 4.路易斯安那州立大學食品科學系， 巴吞魯日 70803)

對2種葡萄皮及其釀造的葡萄酒中粗酚進行提取，測定其體外DPPH清除率和總抗氧化能力，進一步利用轉基因斑馬魚對提取物進行血管生成抑制活性檢測。提取物處理斑馬魚胚胎22 h后，統計斑馬魚體節間血管的生長情況及提取物對斑馬魚體節間血管的抑制作用。試驗結果顯示，葡萄酒和葡萄皮均具有一定的體外抗氧化活性，但葡萄酒的DPPH清除率和總抗氧化能力均高于葡萄皮，其中葡萄酒1的DPPH清除率最高，為89.42%；比葡萄酒2高1.29個百分點，總抗氧化能力葡萄酒2最高，為223.24 U/mL；葡萄酒粗酚提取物能明顯抑制斑馬魚血管生成，且節間血管數量較對照組明顯減少，其中葡萄酒1的背長軸和體節間血管抑制效果更好；而葡萄皮粗酚提取物對斑馬魚血管生成無任何作用。

葡萄酒； 多酚類物質； 抗氧化活性； 斑馬魚； 血管生成

引言

血管生成即從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發展而形成新血管的過程，內皮細胞的激活、增殖和遷移在此過程中扮演重要角色。在正常情況下，生理性的血管生成是必要條件，如正常組織發育、生殖、傷口愈合修復等，而持續的血管生成即病理性血管生成則是某些病變，如腫瘤組織的惡性增長、糖尿病性視網膜病變等[1]。因為腫瘤的生長對血管生成具有依賴性，一方面，腫瘤通過誘導新生血管生成為其提供充足的營養物質；另一方面，新生血管的形成提供了腫瘤細胞遠位轉移的通道。因此有效抑制腫瘤誘導的新生血管生成將有效防治癌癥。

目前，抗血管生成已成為腫瘤治療的良好策略，而開發血管生成抑制劑也隨之成為腫瘤研究的焦點。與傳統抗腫瘤藥物相比，血管生成抑制劑優點在于：抗腫瘤血管生成藥物起到通過減少或阻斷腫瘤組織的血液供應而使腫瘤細胞增殖周期延長，促進腫瘤細胞壞死作用，而不是直接殺死腫瘤細胞，故無明顯的毒副作用，并且應用廣泛，可治療多種腫瘤，同時可克服化療過程中的抗藥性問題[2-3]。

多酚物質是紅葡萄酒的主要成分之一，具有延緩衰老、預防心血管疾病、預防癌癥、抗炎癥等作用[4-8]，但紅酒多酚是否具有抑制動物血管生成活性，國內外尚未見研究報道。本文利用內皮細胞表達增強型綠色熒光蛋白的轉基因斑馬魚品系Tg(flk1：EGFP)，在熒光顯微鏡下觀察受精后22 h內斑馬魚胚胎內體節間血管的生成情況，從而對葡萄酒粗酚提取物抑制血管生成活性及機制進行初步研究，為預防腫瘤和血液病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 葡萄外皮粗酚提取

葡萄品種不同(標記為葡萄1、葡萄2)，但均為歐亞屬，采于陜西省楊凌區曹辛莊，采收當天于-80℃冰箱分別冷凍葡萄50粒，流水下剝取葡萄皮，液氮冷凍粉碎成粉末，于凍干機中凍干24 h，取出裝于自封袋中，存放于-80℃冰箱。稱取1 g過60目篩干粉于50 mL離心管中(離心管需用黑膠帶或錫箔紙包裹)，加入10 mL 0.1%鹽酸甲醇溶液，于60℃水浴鍋中提取30 min取出，于10 000 r/min下離心10 min，收集上清液于離心管中，重復以上提取步驟2次，合并3次所有上清液于離心管中，上清液經過濾后收集，濾液經旋轉蒸發儀(小于40℃)蒸餾濃縮至體積小于原體積的5%，定容至5 mL備用。

1.1.2 紅葡萄酒的濃縮

由上述葡萄1、葡萄2自釀紅葡萄酒，得到對應的葡萄酒1、葡萄酒2。分別取100 mL紅酒于旋轉蒸發瓶中，在38℃下旋轉蒸發濃縮至體積小于原體積的15%，于凍干機中凍干24 h得濃縮干塊，-80℃冰箱存放備用。

1.1.3 試驗動物

采用轉基因斑馬魚品系Tg(flk1:EGFP)，該轉基因斑馬魚品系內皮細胞表達含有flk1啟動子控制的增強綠色熒光蛋白，因而血管可在熒光顯微鏡下觀察，以便發現藥物對血管的作用。斑馬魚胚胎由Tg(flk1:EGFP)純合子或雜合子與野生型配對自然交配獲得，每次交配準備4或5對成年斑馬魚，平均每對能產 200～300個胚胎。所用斑馬魚均由上海南方模式生物研究中心提供。斑馬魚飼養于全封閉循環系統，養殖和繁殖均參照Zebrafish Book 標準[9]，魚房內光照、黑暗時間14 h、10 h，室內溫度26℃，水溫28.5℃，每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率480～510 μS/cm；pH值6.9～7.2，其各項水質指標均合要求。

1.1.4 試劑

二甲基亞砜(DMSO，分析純，上海西隴化工有限公司); 三卡因甲磺酸(分析純，Sigma-Aldrich公司)；斑馬魚胚胎培養液(參照Zebrafish Book標準，0.137 mol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.25 mmol/L Na2HPO4，0.44 mmol/L K2HPO4，1.3 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，4.2 mmol/L NaHCO3); PBS緩沖液(8.0 g NaCl，0.2 g KCl，0.24 g K2HPO4，3.62 g Na2HPO4·12H2O，先用少量超純水依次溶解，再加至1 000 mL，鹽酸調pH值至7.0)；固定液(用PBS緩沖液配制4%多聚甲醛固定液)；總抗氧化能力試劑盒(南京建成科技有限公司)；沒食子酸(標準品，購自中國食品藥品檢定研究院)；氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉等(分析純，購自上海科興商貿有限公司)。

1.2 儀器與設備

XSE104型萬分之一電子天平(上海巴玖實業有限公司)；DZF-6090型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；RQX-400智能型人工氣候箱(上海市百典儀器廠)；Nikon SMZ1500型高配置體式熒光顯微鏡(日本尼康公司)；TGL-18M型臺式高速冷凍離心機(上海盧湘離心機儀器有限公司)；R214-B3型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)；UV-1700型紫外可見分光光度計(日本島津貿易有限公司)；AL204型萬分之一天平(瑞士梅特勒公司)；MP511型酸度計(上海精密儀器儀表有限公司)；WTY型手持糖度計(北京鑫潤科諾儀器儀表有限公司)。

1.3 方法

總糖測定參照斐林試劑滴定法[10]；總酸測定參照氫氧化鈉滴定法[10]；pH值參照酸度計法測定[10]；可溶性固形物測定參照手持糖度計法[10]；色度測定[11]方法為：將葡萄原酒經0.45 μm濾膜過濾后分別測其pH值，并用相同pH值的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10倍，測定其在420、520、620 nm下的吸光度(A1、A2、A3)，吸光度之和乘以吸光倍數即為該葡萄酒的色度。

酒精度、干浸出物測定參照文獻[12]；總酚含量測定參照福林-消卡法，結果以沒食子酸計[13]；DPPH清除率測定參考孟江飛[14]的方法稍做調整后進行。DPPH自由基清除率公式為

U=(A2-A)/A×100%

式中A2——樣品吸光度測定值A——蒸餾水代替樣品時的空白測定值

總抗氧化能力測定參照試劑盒法；斑馬魚胚胎血管生成活性測定方法如下：

轉基因斑馬魚受精后在光照、黑暗時間為14 h、10 h，28.5℃的人工氣候箱內孵育22 h后對胚胎進行清理，移除已死亡胚胎，并根據胚胎的發育階段挑選合適的胚胎[15]。因為胚胎可以從自身的卵黃囊中獲取營養物質，所以在受精后9 d內不需要喂食。用三卡因甲磺酸對各個發育階段的斑馬魚進行過度暴露處理，從而將斑馬魚麻醉處死；麻醉處死的操作步驟符合美國獸醫協會(AVMA)對動物麻醉處死的規范要求。為了評估斑馬魚胚胎血管生成活性，稱取一定量的葡萄干粉和葡萄酒提取物濃縮干塊，稀釋于0.1%二甲基亞砜(DMSO)中制成100 μg/mL的初始質量濃度，加入到12孔板中，將孵化22 h的胚胎也同時分配到上述12孔板中，每孔30胚胎，于人工氣候箱中繼續孵化26 h，即為其治療期，觀察血管生成情況。同時設定陽性對照和陰性對照，其中沒有添加藥物的胚胎作為陰性對照，本試驗采用質量分數為0.1%的DMSO，在這個質量分數下不會對斑馬魚的生長和發育產生形態上的影響，而一種VEGFR抑制劑即5 μm新型酪氨酸激酶抑制劑vatalanib(即PTK787)作為陽性對照[16-17]。篩選出有效葡萄酒的標準為：處理后斑馬魚胚胎活力較好，且節間血管數量顯著減少。試驗結束后，胚胎用三卡因甲磺酸處理，再用胚胎培養液潤洗，4%多聚甲醛液固定，4℃冰箱放置12 h，用PBS液沖洗，然后將斑馬魚取出分別置于載玻片上，熒光顯微鏡下成像觀察拍照體節間血管生長情況以及對節間血管形成進行分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄和葡萄酒的理化性質結果

總糖、總酸、pH值、可溶性固形物、總酚含量等指標一般用來評價釀酒葡萄和葡萄酒的品質；在一定范圍內，葡萄含糖量越高，所釀葡萄酒的質量越好。李明記等[18-19]認為，釀酒葡萄的適宜總酸質量濃度為6～10 g/L；適宜的pH值應在3.00～3.60之間。適當的糖酸比應為32左右。

由表1可知，所選2種葡萄糖酸比分別為31.79和33.15，均在32左右，屬于適宜糖酸比；對應釀制的葡萄酒酒精度最大值為13.34%，干浸出物質量濃度最大值為36.92 g/L；總糖質量濃度分別為3.52 g/L和3.85 g/L，上述指標均符合國標規定的干型酒標準；pH值分別為3.53和3.36，屬于適宜pH值范圍。葡萄和葡萄酒的所有測定指標均符合相關標準[12]。測定葡萄理化性質一方面可以直接反映對應釀制的葡萄酒品質，另一方面也可以間接說明葡萄皮的一些性質。

表1 葡萄和葡萄酒理化性質測定結果
Tab.1 Physical and chemical properties of grape and wine

類別總糖質量濃度/(g·L-1)總酸質量濃度/(g·L-1)pH值可溶性固形物質量分數/%色度酒精度/%干浸出物質量濃度/(g·L-1)總酚質量濃度/(mg·L-1)葡萄1165±0.860a5.19±0.112c3.73±0.0120b7.43±0.058c94.21±5.58a葡萄2178±1.260b5.37±0.220b3.67±0.0058a7.83±0.153b101.34±5.06b葡萄酒13.52±2.570a5.25±0.057a3.53±0.0150c5.20±0.200a3.54±0.050ab12.87±0.062a35.08±2.566c213.96±6.05c葡萄酒23.85±1.155c5.07±0.078b3.36±0.0058c4.07±0.062b6.53±0.208b13.34±0.020a36.92±1.155a234.05±6.06b

2.2 體外抗氧化結果

2.2.1 葡萄皮和葡萄酒DPPH清除率的測定結果

DPPH是一種典型的用于體外抗氧化性評價的化學物質[20]，本試驗對葡萄皮和葡萄酒粗酚提取液的DPPH自由基消除率進行測定，結果見圖1。由圖1可知葡萄皮2的DPPH清除率更高，為60.97%，比葡萄皮1高16.61個百分點；而對應的葡萄酒提取液的DPPH自由基消除率相當，葡萄1釀制的葡萄酒1清除率更好，為89.42%；比葡萄酒2高1.29個百分點。由表2可知，葡萄酒的DPPH清除率遠大于葡萄皮(p<0.05)。

圖1 葡萄和葡萄酒的DPPH清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging activities of grape and wine

因素偏差平方和自由度FF臨界值顯著性葡萄134.48217.244.8794*葡萄240.2628.374.8794*葡萄酒151.22225.614.8794*葡萄酒250.73225.374.8794*誤差4.117

注：*表示在α=0.05水平下差異顯著，下同。

圖2 葡萄和葡萄酒的總抗氧化能力測定結果Fig.2 Total antioxidant capability of grape and wine

2.2.2 葡萄皮和葡萄酒總抗氧化能力的測定結果

由圖2和表3可知，葡萄酒總抗氧化能力遠大于葡萄皮(p<0.05)，其中葡萄酒2總抗氧化能力最高，為223.24 U/mL，其次為葡萄酒1，總抗氧化能力為178.98 U/mL，最低為葡萄皮1總抗氧化能力，僅為105.30 U/mL，比葡萄酒2低117.94 U/mL。由此進一步證明，葡萄酒具有較強的抗氧化能力，適當飲用對人體健康有益。

表3 總抗氧化方差分析結果
Tab.3 Variance analysis result of total antioxidant capability

有抗氧化作用的物質在一定程度上也具有抑制腫瘤的功能[21]，而腫瘤的生長和轉移依賴于腫瘤血管[22]，為了研究具有抗氧化作用的葡萄酒是否也具有抑制血管生成的功能，進行了血管生成試驗。

2.3 葡萄皮和葡萄酒粗酚提取物對斑馬魚模型的安全性分析結果

把葡萄酒作為藥物進行試驗，一般情況下，大劑量的藥物會對斑馬魚造成明顯的毒害，引起斑馬魚的死亡，因此在試驗前應該篩選待測物質葡萄皮和葡萄酒對斑馬魚的毒性作用，從而得到測試葡萄皮和葡萄酒的最適濃度，即可抑制斑馬魚血管生成而無明顯毒副作用的最小劑量。

由表4可以看出葡萄皮提取物對斑馬魚及胚胎無明顯毒性，因此認為100 μg/mL的提取物質量濃度對斑馬魚及胚胎是安全的，而且葡萄皮提取物與血管生成抑制劑PTK787同樣具有抑制血管生成作用。

表4 葡萄皮、葡萄酒提取物的斑馬魚篩選試驗Tab.4 Screening experiment of grape skin and wine extracts in zebrafish model %

2.4 葡萄皮粗酚提取物對斑馬魚胚胎體節間血管生成的抑制作用

無論是原發腫瘤還是轉移性腫瘤的生長和擴散均與血管形成密切相關，腫瘤血管除向腫瘤細胞提供營養外，還不斷地向人體其他部位輸送腫瘤細胞，導致惡性腫瘤的生長和轉移[23-24]。因此，抑制血管生成是抑制腫瘤細胞生長轉移的有效手段。

圖3 葡萄果皮粗酚提取物對斑馬魚胚胎體節間血管生成的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of grape skin on trunk angiogenesis in zebrafish

由圖3可以看出，葡萄皮1、葡萄皮2粗粉提取物對斑馬魚胚胎體節間血管生成均無明顯作用，尤其葡萄皮2喂食斑馬魚，胚胎放大后影像與對照組結果完全一致，葡萄皮1放大后斑馬魚胚胎體節間血管影像稍有弱化。由此可見，葡萄皮1、葡萄皮2粗粉提取物對斑馬魚血管生成沒有抑制作用。

圖4 葡萄酒1粗酚提取物對斑馬魚胚胎體節間血管生成的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of wine 1 on trunk angiogenesis in zebrafish

2.5 葡萄酒粗酚提取物對斑馬魚胚胎體節間血管生成的抑制作用

斑馬魚節間血管發育時間為24～48 h[25]，本試驗中選擇胚胎發育22 h血管尚未發育的斑馬魚作為受試對象，于胚胎培養液中加入葡萄酒提取物，繼續培養26 h后剝除卵膜，在熒光顯微鏡下觀察血管生成情況。

圖5 葡萄酒2粗酚提取物對斑馬魚胚胎體節間血管生成的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of wine 2 on trunk angiogenesis in zebrafish

由圖4、5可以看出，葡萄酒粗酚提取物處理斑馬魚胚胎26 h后，斑馬魚背長軸血管和體節間血管基本消失，均已模糊看不出，與對照組相比，斑馬魚胚胎飲用葡萄酒粗酚提取物后背長軸血管和體節間血管形態不完全或部分缺失，僅隱約能見背主動脈的肉芽，且體節間血管數量較對照組明顯減少，血管生成受到明顯抑制。試驗結果表明葡萄酒粗酚提取物具有部分抑制血管異常生成的作用，但又不影響背主動脈和靜脈血管的完整性，即葡萄酒粗酚提取物具有抗血管生成的藥理活性，且葡萄酒1粗酚提取物對斑馬魚胚胎體節間血管生成的抑制作用大于葡萄酒2。由對照組可以看出，背長軸血管和體節間血管均完整，由對照組用抑制劑PTK787后的表象圖可以看出，PTK787 具有明顯抑制背長軸血管和體節間血管生成的作用，使用后已經完全看不到2種血管，說明抑制效果非常明顯。

3 討論

斑馬魚是幅鰭亞綱鯉科短擔尼魚屬的一種熱帶淡水硬骨魚，主要分布于印度恒河流域[26]。2009年斑馬魚全基因組測序完成，斑馬魚體內存在的人類同源基因比例高達87%，某些疾病相關基因與人類基因保守性高達99%，這意味著在其身上做藥物試驗所得到的結果在多數情況下也適用于人體[26-28]。因此斑馬魚成為一種公認的新型模式生物[29-30]。

抑制血管生成是抗腫瘤治療研究的熱點，文獻[31]也證實了血管生成是腫瘤生長的關鍵。實體腫瘤的生長必須依賴持續和廣泛的血管生成，無血管狀態的腫瘤極少超過2～3 mm，新生的腫瘤血管可持續不斷地為腫瘤細胞提供營養及氧氣，帶走代謝產物，而且腫瘤血管也是腫瘤轉移的主要途徑。血管的生成是一個復雜的過程，受血管刺激因子和血管抑制因子的調節[23-24]。因此研究血管生成調節與腫瘤的關系有著重要的理論意義及臨床價值，針對腫瘤血管形成的某些因子及其關鍵步驟進行干預，可切斷腫瘤血供及轉移途徑，對腫瘤的治療具有重要的意義。

4 結束語

以斑馬魚為試驗模型，表明葡萄酒能有效抑制斑馬魚胚胎發育的體節間血管生成。試驗選取與血管生成關系密切的節間血管、背長軸血管和肉芽作為指標，對斑馬魚胚胎的血管生成進行研究，結果顯示葡萄皮粗酚提取物對抑制斑馬魚體節間血管生成則無明顯作用，而斑馬魚胚胎飲用 2 種葡萄酒后的體節間血管的生成明顯減少，說明葡萄酒粗酚提取物對抑制血管生成，即對抑制腫瘤發生有一定的作用。

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Effect of Crude Phenol Extract in Grape Skin and Wine on Angiogenesis Activity of Zebrafish

SUN Haiyan1,2WANG Hua3XU Zhimin4LI Hua3

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100，China2.ShaanxiKeyLaboratoryofResourceBiology,ShaanxiSci-TechUniversity,Hanzhong723000，China3.CollegeofEnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100，China4.DepartmentofFoodScience,LouisianaStateUniversity,BatonRouge,LA70803,USA)

Crude polyphenols were extracted from two types of grape skins and two wines. Total antioxidant activities and in vitro DPPH free radical scavenging activities of the extracts were evaluated. Meanwhile, the effect of those extracts on angiogenesis inhibition was investigated by using transgenic zebrafish model. After zebrafish embryos were treated with the crude polyphenol extracts for 22 h, the inhibitory effect on the intersegmental vessel (ISV) of zebrafish was investigated. The results indicated that the wines and grape skins all had in vitro antioxidant activities. However, the DPPH free radical scavenging activity and total antioxidant activity of wines were higher than those of grape skins. Wine 1 had the highest DPPH free radical scavenging activity (89.42%), which was 1.29 percentage points higher than that of wine 2. Wine 2 had the highest total antioxidant activity of 223.24 U/mL. Compared with control groups, zebrafish treated with crude polyphenol extracts of wines had significantly less ISV formation. Wine 1 had better inhibitory activity on ISV and dorsal longitudinal anastomotic vessel (DLAV) formation. However, the crude polyphenol extracts of grape skins showed little inhibitory effects on ISV and DLAV formation of zebrafish.

wine; polyphenol; antioxidant activity; zebrafish; angiogenesis

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.01.034

2016-05-18

2016-11-19

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD31B00)、西北農林科技大學2013年試驗成果轉化項目(XNY2013-64)和國家火炬計劃項目(2011GH551976)

孫海燕(1979—)，女，博士生，陜西理工大學講師，主要從事食品功能與化學研究，E-mail： diyson2008@163.com

王華(1959—)，女，教授，博士生導師，主要從事葡萄與葡萄酒學研究，E-mail： wanghua@nwsuaf.edu.cn

TS201.2; R730.1

A

1000-1298(2017)01-0260-07