枯草芽孢桿菌ZC1高密度培養的條件優化

管國強，崔鵬景，宋慶春，王源，何素，黃達明

(1.江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.鎮江格瑞生物工程有限公司，江蘇 鎮江 212009)

枯草芽孢桿菌ZC1高密度培養的條件優化

管國強1，崔鵬景2*，宋慶春1，王源1，何素1，黃達明1

(1.江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.鎮江格瑞生物工程有限公司，江蘇 鎮江 212009)

在搖瓶發酵條件下，采用單因素實驗和響應面分析法對枯草芽孢桿菌ZC1的發酵培養基和條件進行優化，以提高其活菌數。通過單因素實驗和響應面分析，確定了枯草芽孢桿菌ZC1的最佳發酵培養基：豆粕粉24 g/L、葡萄糖6 g/L、氯化鈉8 g/L；發酵條件：發酵溫度37 ℃、初始pH 7.5、接種量4%、搖床轉速200 r/min。在此條件下，發酵24 h，枯草芽孢桿菌ZC1的活菌數由原來的1.13×1010cfu/mL提高到3.69×1010cfu/mL。

枯草芽孢桿菌；響應面；活菌含量

枯草芽孢桿菌呈桿狀，很少成鏈，染色均勻，鞭毛側生，芽孢0.8 μm×1.5 μm～1.8 μm游離狀態的芽孢表面著色弱，萌發時芽孢殼赤道裂[1]。由于枯草芽孢桿菌生長速度快，營養需求簡單，對環境耐受能力強，且具有微生物普遍存在的遺傳可操作性等優點，所以成為一種常用的工業模式菌，在調味品行業、發酵、植物病害防治、養殖業、微生態制劑及醫學上都有廣闊的應用前景[2-4]。在調味品行業枯草芽孢桿菌應用比較廣泛，枯草芽孢桿菌產生的酶可以用于制作淀粉糖、味精、檸檬酸、氨基酸等調味品及食品添加劑。

本課題組前期在實驗室保藏的芽孢桿菌中篩選出一種高產中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌ZC1，用于發酵生產氨基酸等調味品及食品添加劑。為了提高枯草芽孢桿菌ZC1中性蛋白酶的產量，首先需要提高種子液中枯草芽孢桿菌ZC1的活菌含量。目前，提高枯草芽孢桿菌活菌含量，主要是通過培養基和發酵條件優化及發酵罐補料調控培養來實現。如張麗霞等[5]對枯草芽孢桿菌發酵培養基進行優化，使得發酵液中菌含量從0.6×109cfu/mL提高到1.18×1010cfu/mL。賈鈞輝等[6]用7 g/L發酵罐對枯草芽孢桿菌B579進行補料發酵培養，當葡萄糖濃度下降到3 g/L時，進行流加葡萄糖至濃度3～6 g/L，控制pH為7.0，發酵24 h，菌含量高達3.9×1010cfu/mL，是分批發酵的7.5倍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌ZC1 江蘇大學食品與生物工程學院409實驗室保藏。

豆粕粉 菜場購得；葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘油、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

YC-L型冷凍恒溫振蕩器 鎮江格瑞生物工程有限公司；立體式全自動高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司；MP5002電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；101-2A型電熱恒溫鼓風干燥箱 金壇市鑫鑫實驗儀器廠；快速混勻器 江蘇中大儀器廠。

1.2 培養基

1.2.1 種子培養基

大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L。

1.2.2 斜面培養基

大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L。

1.2.3 基礎發酵培養基

豆粕粉20 g，蒸餾水 1000 mL。

1.3 實驗方法

1.3.1 活菌菌含量測定

枯草芽孢桿菌ZC1活菌菌含量的測定采用稀釋涂布平板法[7]。

1.3.2 枯草芽孢桿菌ZC1的活化及種子液的制備

將枯草芽孢桿菌ZC1轉接到斜面培養基中，37 ℃培養24 h，備用。在斜面上挑取2環活化后的枯草芽孢桿菌ZC1，接入初始pH為7.2的種子液中，裝液量為50 mL/250 mL，在37 ℃，轉速180 r/min的搖床上培養18 h。

1.3.3 枯草芽孢桿菌ZC1生長曲線的測定

配制15組種子培養基，裝液量統一為50 mL/250 mL，分別編號1～15。向1～15號種子培養基中各加入2環枯草芽孢桿菌，搖勻。發酵條件同上，在搖床上培養30 h。此后，每隔2 h測種子培養基的OD值(600 nm)，以下簡稱OD600，即在培養第2 h，測1號種子培養基的OD600；在培養第4 h，測2號種子培養基的OD600；以此類推，直到測完培養30 h，第15號培養基的OD600。

1.3.4 單因素實驗

1.3.4.1 不同碳源對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

向基礎發酵培養基中分別添加1%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、甘油，以不加碳源為空白。采用搖瓶發酵培養，在接種量4%、發酵液初始pH 7.2，裝液量50 mL/250 mL，發酵溫度37 ℃，搖床轉速180 r/min的條件下，發酵24 h后檢測發酵液中的活菌含量，確定最佳碳源。

1.3.4.2 不同無機鹽對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

確定最佳碳源后，向基礎發酵培養基中添加1%最佳碳源以及分別添加0.6%的氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳，以不加無機鹽為空白。采用搖瓶發酵，發酵條件同上，發酵24 h后檢測發酵液中的活菌含量，確定最佳無機鹽。

1.3.4.3 不同豆粕粉、葡萄糖及氯化鈉濃度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

由上述實驗確定最佳碳源為葡萄糖，最佳無機鹽為氯化鈉。隨后采用濃度梯度方法，發酵條件一致，搖瓶發酵培養24 h后檢測發酵液中的活菌含量，確定各組分最佳濃度。豆粕粉濃度分別為12，16，20，24，28，32 g/L，葡萄糖濃度分別為2，6，10，14，18 g/L，氯化鈉濃度分別為3，6，9，12，15 g/L。

1.3.5 最陡爬坡試驗

以適當的梯度改變豆粕粉、葡萄糖、氯化鈉在培養基中的濃度，考察菌含量的變化趨勢，確定最適濃度范圍。

1.3.6 正交試驗設計

根據單因素試驗和最陡爬坡試驗的結果，設計三因素三水平的正交試驗，對枯草芽孢桿菌ZC1菌含量進行進一步優化。試驗設計的因素水平以及編碼見表1。對得到的組合進行試驗驗證。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.7 枯草芽孢桿菌ZC1發酵條件的優化

1.3.7.1 溫度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

將接好種子液的培養基分別置于28，31，34，37，40 ℃的搖床中，培養24 h，檢測其菌含量，其他發酵條件為培養基初始pH 7.2，接種量4%，搖床轉速180 r/min。

1.3.7.2 pH對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

將培養基的初始pH分別調為6.5，7，7.5，8，8.5，同樣接入4%的種子液，在37 ℃，180 r/min搖床上，培養24 h，檢測其菌含量。

1.3.7.3 接種量對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

向初始pH為7.2的培養基中分別接入2%，4%，6%，8%，10%的種子液，在37 ℃，180 r/min的搖床上，培養24 h，檢測其菌含量。

1.3.7.4 搖床轉速對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

向初始pH為7.2的培養基中接入4%的種子液，37 ℃條件下，分別在轉速50，100，150，200，250 r/min的搖床中培養24 h，檢測其菌含量。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌ZC1的生長曲線

微生物的生長一般分為延滯期、對數期、穩定期以及衰亡期[8]。

圖1 枯草芽孢桿菌ZC1生長曲線

由圖1可知，枯草芽孢桿菌ZC1延滯期較短，在0～2 h，枯草芽孢桿菌ZC1數量較少；在2～10 h，枯草芽孢桿菌ZC1進入生長對數期，菌含量急速增加；在12～24 h，枯草芽孢桿菌ZC1生長趨于平穩，細胞活力較高，在24 h左右時菌含量達到最高。之后隨著培養基的營養成分減少，有害代謝物增多，菌種慢慢進入衰亡期。由此可知，選擇16～24 h時的菌液進行接種較為合適。

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同碳源對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

碳源在枯草芽孢桿菌的生長過程中起著至關重要的作用，為其生長代謝提供能量[9]。

圖2 不同碳源對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

由圖2可知，選用玉米粉和甘油作為碳源對枯草芽孢桿菌ZC1的菌含量提高不明顯。而采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源，菌含量都達到了2.5×1010cfu/mL左右。這從一定角度說明枯草芽孢桿菌ZC1直接利用單糖以及二糖優于玉米粉和醇類碳源，而在單糖和二糖中，枯草芽孢桿菌ZC1利用葡萄糖能力最佳。

2.2.2 不同無機鹽對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

無機鹽是微生物生長必不可少的營養因子，可維持生物大分子和細胞結構的穩定性，在微生物生長過程中起著重要的作用[10]。

圖3 不同無機鹽對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

由圖3可知，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂這幾組與空白組的枯草芽孢桿菌ZC1含菌量差距不大，說明這幾種鹽對枯草芽孢桿菌ZC1生長影響不大，而氯化鈉對枯草芽孢桿菌ZC1生長具有一定的促進作用。另外，硫酸錳這組菌含量只有空白組的30%左右，不利于枯草芽孢桿菌ZC1生長，這是由于硫酸錳有助于枯草芽孢桿菌產生芽孢，抑制了枯草芽孢桿菌生長。

2.2.3 不同豆粕粉濃度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

豆粕粉濃度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響見圖4，當豆粕粉濃度為24 g/L時，枯草芽孢桿菌ZC1生長情況最好，菌含量達到了3.14×1010cfu/mL。

圖4 不同豆粕粉濃度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

由圖4可知，豆粕粉過高或過低，枯草芽孢桿菌ZC1生長都會呈現下降趨勢。分析其中原因，當豆粕粉濃度過低時，培養基中營養成分不足，不利于菌種生長；當濃度偏高時，使得發酵液變得粘稠，溶氧下降，也會抑制菌種生長。

2.2.4 不同葡萄糖濃度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

圖5 不同葡萄糖濃度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

由圖5可知，不同葡萄糖濃度對枯草芽孢桿菌ZC1生長具有較大影響，當葡萄糖濃度為6 g/L時，菌種生長較好，而濃度或高或低，都會對枯草芽孢桿菌ZC1生長產生不利影響。這可能是因為葡萄糖濃度過低，使得培養基中營養不夠，不利于菌種生長；濃度過高，使得培養基滲透壓過高，從而導致枯草芽孢桿菌脫水，抑制其生長。

2.2.5 不同氯化鈉濃度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

圖6 不同氯化鈉濃度對枯草芽孢生長ZC1的影響

由圖6可知，當氯化鈉為6 g/L左右時，枯草芽孢桿菌ZC1生長狀況最好，氯化鈉濃度或高或低，枯草芽孢桿菌ZC1生長都會呈現較小趨勢的下滑。這可能是因為氯化鈉濃度過高，會導致發酵液中的滲透壓偏高，菌體細胞容易脫水，抑制枯草芽孢桿菌的生長。

2.3 最陡爬坡試驗

為了進一步確定各組分的最適濃度范圍，在單因素試驗的基礎上，進行最陡爬坡試驗。最陡爬坡實驗設計與結果見表2。

表2 最陡爬坡實驗設計與結果

由表2可知，隨著豆粕粉、葡萄糖和氯化鈉濃度逐步提高，枯草芽孢桿菌ZC1的菌含量呈現出先升高后下降的趨勢。當豆粕粉為24 g/L，葡萄糖為6 g/L，氯化鈉為6 g/L時，菌含量最高，達到了3.48×1010cfu/mL。由此，可以采用此濃度作為正交試驗設計的中心點。

2.4 正交試驗結果及分析

結合單因素實驗和最陡爬坡實驗，確定了豆粕粉、葡萄糖及氯化鈉這3個因素。根據正交設計原理，選擇這3個因素作為自變量，以枯草芽孢桿菌ZC1菌含量為指標，進行三因素三水平正交試驗設計。其他發酵條件：發酵溫度37 ℃，裝液量為50 mL/250 mL，初始pH 7.2，搖床轉速180 r/min，接種量4%。正交試驗設計及結果見表3。

表3 正交試驗設計及結果

由表3可知，豆粕粉、葡萄糖和氯化鈉對枯草芽孢桿菌ZC1菌含量影響的主次因素為A>B>C，其中當豆粕粉含量為20～28 g/L時，對枯草芽孢桿菌菌含量影響較為顯著；豆粕粉含量在24 g/L時，枯草芽孢桿菌菌含量最高；氯化鈉在4～8 g/L之間時，對菌含量影響不大。根據極差值，得到最佳發酵培養基組合為A2B2C3。培養基組成：豆粕粉24 g/L、葡萄糖6 g/L、氯化鈉8 g/L。在此條件下，進行3次重復試驗驗證，分別測得枯草芽孢桿菌菌含量為3.48×1010，3.52×1010，3.60×1010cfu/mL，平均菌含量為3.53×1010cfu/mL，證明正交試驗優化得到的豆粕培養基具有一定指導意義。

2.5 枯草芽孢桿菌ZC1發酵條件的優化

2.5.1 發酵溫度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

圖7 發酵溫度對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

由圖7可知，發酵溫度在枯草芽孢桿菌生長繁殖過程中起到至關重要的作用?？莶菅挎邨U菌ZC1在發酵溫度為28～40 ℃，培養24 h，活菌含量較穩定，隨著溫度變化，菌含量先增高后降低，其中發酵溫度為37 ℃時，菌含量最高，達到了3.49×1010cfu/mL。

2.5.2 不同初始pH對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

圖8 初始pH對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

由圖8可知，枯草芽孢桿菌ZC1的初始pH值為7.0～8.0時，生長較為穩定；當初始pH為7.5左右時，最適枯草芽孢桿菌ZC1生長增殖，菌含量達到3.59×1010cfu/mL。pH值過高或過低都不利于枯草芽孢桿菌ZC1的生長。

2.5.3 接種量對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

圖9 接種量對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

由圖9可知，當接種量為4%時，枯草芽孢桿菌ZC1菌含量最高，并非接種量越高，菌含量越高，這可能是由于接種量過高，發酵前期發酵液中營養物質大量消耗，引起菌種的提前衰亡，不利于枯草芽孢桿菌ZC1的高密度培養。

2.5.4 搖床轉速對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

圖10 搖床轉速對枯草芽孢桿菌ZC1生長的影響

由圖10可知，隨著搖床轉速增高，枯草芽孢桿菌ZC1菌含量先增高后降低，當搖床轉速為200 r/min時，枯草芽孢桿菌菌含量最優，達到3.62×1010cfu/mL。分析其原因，當搖床轉速過低，導致通氣量偏低時，搖瓶底部的菌種供氧不足，抑制其生長；當搖床轉速過快時，導致發酵液內部剪切力偏大，引起菌種機械損傷，不利于生長。

2.6 驗證試驗

采用上述優化得到的高密度培養條件，培養枯草芽孢桿菌ZC1，發酵24 h，檢測發酵液中枯草芽孢桿菌ZC1的活菌含量，3個平行組的菌含量分別為3.72×1010，3.58×1010，3.76×1010cfu/mL，平均值為3.69×1010cfu/mL?？梢钥闯霭l酵液中枯草芽孢桿菌ZC1的活菌含量明顯提高，是優化前的3.5倍。

3 結論

本文考察了不同營養因子和發酵條件對枯草芽孢桿菌ZC1高密度培養的影響。通過單因素試驗和響應面分析確定了枯草芽孢桿菌ZC1高密度培養的條件為豆粕粉24 g/L，葡萄糖6 g/L，氯化鈉8 g/L，發酵溫度37 ℃，初始pH 7.5，接種量4%，搖床轉速200 r/min。在此條件下培養24 h，枯草芽孢桿菌ZC1活菌含量高達3.69×1010cfu/mL，大大提高了其活菌數，對后續中性蛋白酶酶解蛋白質生產氨基酸等調味品及食品添加劑有比較重要的意義。

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Optimization of High-density Cultivation Conditions ofBacillussubtilisZC1

GUAN Guo-qiang1, CUI Peng-jing2*, SONG Qing-chun1, WANG Yuan1, HE Su1, HUANG Da-ming1

(1.School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2.Zhenjiang Green Bio-Engineering Co., Ltd., Zhenjiang 212009, China)

By shake flask fermentation, in order to increase the viable count ofBacillussubtilisZC1, the fermentation medium and conditions ofBacillussubtilisZC1 are optimized by single factor experiment and response surface methodology. According to the single factor experiment and response surface methodology, the optimal fermentation medium and conditions are as follows: soybean meal is 24 g/L, glucose is 6 g/L, sodium chloride is 8 g/L, fermentation temperature is 37 ℃, initial pH is 7.5, inoculation amount is 4%, shaking speed is 200 r/min. Being fermented for 24 h, the viable count ofBacillussubtilisZC1 is increased from 1.13×1010cfu/mL to 3.69×1010cfu/mL under such conditions.

Bacillussubtilis;response surface; viable count

2016-07-15 *通訊作者

管國強(1975-)，男，安徽巢湖人，助理研究員，研究方向：生物工程。

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.004

1000-9973(2017)01-0013-05