永州山銀花中綠原酸提取工藝研究及含量測定

張衛(wèi)軍　陳　建

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永州山銀花中綠原酸提取工藝研究及含量測定

張衛(wèi)軍陳建

（湖南科技學院 化學與生物工程學院，湖南 永州 425199）

論文以永州山銀花為原料，以山銀花中綠原酸的含量為考察指標，采用乙醇回流提取法和紫外可見分光光度法，通過單因素試驗研究了乙醇體積分數(shù)、浸提時間、浸提溫度、料液比對山銀花中綠原酸浸提量的影響。利用正交試驗優(yōu)化選擇，以主要影響因素做正交試驗。通過方差分析得到最佳提取工藝為：料液比1：20，乙醇體積分數(shù)70%，浸提溫度70℃，提取時間120 min。在此條件下綠原酸提取得率為2.86%。此法簡單可行，經(jīng)濟適用且環(huán)保，適于工業(yè)化大生產(chǎn)。

永州山銀花；綠原酸；提取工藝

1　引　言

山銀花為忍冬科植物紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或初開的花[1]，具有清熱解毒、護肝明目、抗菌、降壓、免疫調(diào)節(jié)等功效[2]。山銀花的主要有效成分是有機酸類、黃酮類化合物及皂苷，其中綠原酸是山銀花的主要藥效活性成分之一[3]。綠原酸還是食品、藥品、化妝品等工業(yè)的重要原料[4-5]。近來研究表明綠原酸還具有抗白血病的作用[6]。因此，開發(fā)綠原酸市場前景廣闊、發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

天然藥物之所以具有重要藥用價值，其原因在于其所含的有效成分具有生物活性[7]。據(jù)中藥特點，有效成分不僅是藥用植物的藥效基礎，也是評價中藥質(zhì)量的有效指標。大量研究表明：中藥材所含化學成分復雜多樣，有效成分的含量受地理氣候因素影響較大[8-10]。綠原酸是山銀花中的重要活性成分之一，其含量也應受氣候，溫度，地域等條件的影響。因此，對不同地域、不同氣候、不同土壤環(huán)境下的山銀花中綠原酸成分含量展開研究，對于“南北金銀花”之爭及山銀花質(zhì)量全面控制和科學評價具有重要現(xiàn)實意義。

永州氣候宜人，土壤肥沃，野生山銀花資源豐富，但山銀花研究文獻報道卻是空白。為擴大中藥的藥源途徑，有必要對湖南永州地區(qū)的山銀花進行提取工藝研究及含量測定，為進一步開發(fā)湖南地區(qū)山銀花產(chǎn)業(yè)提供參考和依據(jù)。

2　材料、試劑及儀器

2.1實驗材料

實驗原料為永州地區(qū)山銀花，課題組于2016年4-5月分2次采摘，樣品采后及時陰干并放入45℃干燥箱中干燥，經(jīng)粉碎、過60目試樣篩，密封室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2主要儀器

AUY-120電子分析天平，購自日本島津公司；752型紫外可見分光光度計，購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司；A-88型組織搗碎均勻機，購自金坊市醫(yī)療儀器廠；FW177型中草藥粉碎機和WG-20型電熱鼓風干燥箱，均購自天津市泰斯特儀器有限公司；RE-201D型電熱恒溫水浴鍋，購自長沙太康科技有限公司。

2.3主要試劑

綠原酸標準品（國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇為分析純，實驗所用的50%、70%、90%濃度的乙醇溶液均由此分析純稀釋而來。

3　方法與實驗

3.1對照品標準溶液的配制

取綠原酸對照品5.1 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液并定容至50 mL，搖勻得102 μg/mL的綠原酸對照品溶液，制作標準曲線。在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)此溶液濃度過大，因此取15 mL濃度為102 μg/mL的綠原酸對照品溶液于50 mL容量瓶中，配制成濃度為30.6 μg/mL的對照品溶液。放入冰箱（4℃）待用。

3.2檢測波長的選擇

通過相關(guān)參考文獻及實驗確定最大吸收波長為328.8 nm。

3.3標準曲線繪制

用5 mL移液管精密量取對照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶液定容，搖勻，靜置。其濃度分別為0μg/mL、1.224μg/mL、2.448μg/mL、3.67μg/mL、4.896μg/mL、6.120μg/mL、7.464μg/mL。在328.8 nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，濃度C（μg/mL）為橫坐標，繪制綠原酸的標準曲線（如圖1）。求得線性回歸方程為y＝0.0842x+0.0206，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9998。

圖1. 綠原酸的標準曲線

3.4樣品中綠原酸提取及含量測定

取山銀花粉末0.2 g，精密稱定，置于提取器中，加一定料液比的乙醇溶液，加熱回流一定時間，提取完成后冷卻至室溫，用抽濾機兩次抽慮合并濾液。將濾液即提取液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用相應濃度的乙醇溶液定容至刻度線。用移液管移取1mL放置于另一個25 mL容量瓶中，用相應濃度的乙醇溶液定容至刻度線。用紫外分光光度計測得其吸光度，測三組，取其平均值。按照標準曲線算出其濃度。

測得吸光度A，由標準曲線可得濃度C（mg/L）

4　結(jié)果與分析

4.1單因素實驗結(jié)果與分析

4.1.1乙醇體積分數(shù)對山銀花綠原酸提取得率的影響。準確稱取0.2克/份的山銀花樣品四份，料液比為1∶20。選取提取溶劑分別為50%、60%、70%、90%乙醇溶液，提取溫度為70℃，提取時間為2小時。按３.4方法操作，實驗結(jié)果如圖2。

圖2. 乙醇體積分數(shù)對山銀花中綠原酸提取得率的影響

由圖2可知，乙醇體積分數(shù)在70%之前綠原酸提取得率呈上升趨勢，當乙醇體積分數(shù)達到70%時達到最大值，之后呈下降趨勢，且下降趨勢大，是因為隨著濃度增加，醇溶性物質(zhì)競爭溶解，使山銀花中綠原酸成分溶解度下降，導致了提取率下降。因此，當乙醇體積分數(shù)為70 %時山銀花中綠原酸的提取效果最好。

4.1.2料液比對山銀花綠原酸提取得得率的影響。準確稱取0.2克/份的山銀花樣品四份，分別加入液料比為1:10、1:15、1:20、1:25（g/mL）。提取溶劑為70%的乙醇溶液，提取溫度為70℃，提取時間為2小時。按3.4方法操作，實驗結(jié)果如圖3。

圖3. 料液比對山銀花中綠原酸提取得率的影響

由圖3可以看出，綠原酸提取率隨著料液比的不斷增大而變大，當料液比達到1：20后，綠原酸的提取率的增幅變化不大，且有下降趨勢并開始下降。可能是因為乙醇含量增高，其他物質(zhì)的提取率也隨著增高了，從而影響了綠原酸的提取。所以適宜的料液比為1：20左右。

4.1.3提取時間對綠原酸提取率的影響。準確稱取0.2克/份的山銀花樣品四份，提取溶劑為70%的乙醇溶液，液料比為1:20，提取溫度為70℃，提取時間為分別為1小時、1.5小時、2小時、2.5小時。按3.4方法操作。實驗結(jié)果如圖4。

圖4. 提取時間對山銀花中綠原酸提取率的影響

由圖4可以看出，提取時間在1.5-2.0小時之間綠原酸提取率好。2小時前隨著提取時間的增加提取率的增幅也不大，2小時后略有降低，可能是隨著時間的增加，山銀花中的其它成分或雜質(zhì)浸入提取液中，導致綠原酸的提取率略有降低。考慮經(jīng)濟因素，最宜的提取時間選2小時。

4.1.4溫度對綠原酸提取率的影響。準確稱取0.2克/份的山銀花樣品四份，分別于65℃、70℃、75℃、80℃條件下提取，提取溶劑為70%的乙醇溶液，液料比為1:20，提取時間為2小時。按3.4方法操作，實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5. 提取溫度對山銀花中綠原酸提取率的影響

由圖5可以看出，隨著提取溫度的增加，提取率先升后降，當溫度達到70℃時提取率最高，在70℃前上升的幅度較小，超過70℃后提取率下降幅度較大，原因可能是溫度升高使綠原酸成份受熱被破壞，導致提取率在一定程度上下降。另外，溫度的升高乙醇的揮發(fā)會越來越劇烈，乙醇的消耗會增加，不利于實驗，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，選擇最宜的提取溫度為70℃。

4.2正交試驗結(jié)果及分析

4.2.1正交試驗結(jié)果。在綠原酸的提取過程中，乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取溫度等因素都影響綠原酸的提取得率。根據(jù)綠原酸的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及單因素實驗的結(jié)果和傳統(tǒng)的提取經(jīng)驗，選擇乙醇體積分數(shù)（A）、提取溫度(B)、提取時間(C) 3個因素，以綠原酸得率為指標，采用L9（34）設計進行正交試驗，其因素水平表和正交實驗結(jié)果分別見表1、表2。

表1. 正交分析表

所在列ABC 因素提取時間提取溫度乙醇體積分數(shù)實驗結(jié)果(%) 實驗11(1h)1(65℃)1(50%)2.50 實驗22(1.5)2(70℃）1(50%)2.69 實驗33(2h)3(75℃)1(50%)2.57 實驗42(1.5h)1(65℃)2(70%)2.64 實驗53(2h)2(70℃）2(70%)2.86 實驗61(1h)3(75℃)2(70%)2.70 實驗73(2h)1(65℃)3(90%)2.84 實驗81(1)2(70℃）3(90%)2.80 實驗92(1.5h)3(75℃)3(90%)2.82 k12.5872.6602.667 k22.7332.7832.717 k32.8202.6972.757 R0.2330.1230.090

表2 . 二次回歸方程模型的方差分析表

由表1可以得出各個因素的對綠原酸提取率的影響順序為RA>RB>RC，預測最佳組合為A3B2C2；從表2方差分析數(shù)據(jù)可知提取時間，提取溫度為重要因素，乙醇體積分數(shù)為次要影響，故在工業(yè)化生產(chǎn)中因?qū)⑻崛r間和提取溫度作為關(guān)鍵因素考慮。

4.2.2結(jié)果驗證試驗。為了驗證正交設計選取出來的最佳工藝路線的可靠性，以最佳提取條件A3B2C2做三組平行試驗，山銀銀花以1:20的料液比加入70%乙醇溶液，溫度為70℃的條件下單次，提取2小時，實驗結(jié)果如表3。第一次驗證試驗所得到的結(jié)果為2.84%，第二次驗證試驗所得到的結(jié)果為2.79%，第三次驗證試驗所得到的結(jié)果為2.81%。由數(shù)據(jù)所得三組試驗的結(jié)果相差不大，故最佳的工藝路線為A3B2C2。

表3. 最優(yōu)組合條件下的結(jié)果驗證

試驗號提取率平均值RSD 12.84% 22.79%2.81%0.89% 32.81%

5　結(jié)　論

以永州產(chǎn)野生山銀花為原料，乙醇水溶液為提取劑，經(jīng)單因素實驗正交試驗得出綠原酸提取最優(yōu)條件：乙醇體積分數(shù)為70%，提取溫度為70℃，提取時間2小時，料液比1:20。在此條件下的最優(yōu)提取得率為2.86%，符合國家藥典規(guī)定藥用金銀花中綠原酸最低質(zhì)量分數(shù)1.5%的要求。文章提供永州產(chǎn)山銀花化學活性成分——綠原酸含量等基礎資料，為揭示永州山銀花綠原酸含量及品質(zhì)與地理氣候因素之間的關(guān)系，為山銀花產(chǎn)地溯源提供參考依據(jù)。

乙醇回流提取山銀花中的綠原酸是一種比較高效率的提取方法，操作簡單、條件溫和，節(jié)約成本、耗時短，能夠滿足工廠的大規(guī)模生產(chǎn)。

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（責任編校：宮彥軍）

2017－01－08

張衛(wèi)軍（1969－），男，湖南永州人，湖南科技學院研究員，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物化學與分析化學。

S567.9

A

1673-2219（2017）10-0051-03