西藏自治區產堿性彈性蛋白酶枯草芽孢桿菌的分離及鑒定

馬長中++辜雪冬++池福敏++羅章++楊林

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.144

摘要：從西藏自治區不同海拔地區的屠宰場土壤中分離得到180株菌株，經過初篩和復篩，獲得1株產堿性彈性蛋白酶較高的菌株XZJ4，結合生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

關鍵詞：堿性彈性蛋白酶；分離；鑒定；枯草芽孢桿菌

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0502-03

收稿日期：2015-11-14

基金項目：西藏自治區自然科學基金（編號：Z2012A076）。

作者簡介：馬長中（1975—），男，四川遂寧人，碩士，副教授，主要從事高原特色農畜產品加工及貯藏研究。Tel：（0894）5826471；E-mail：414767450@qq.com。彈性蛋白酶是一種以水解不溶性彈性硬蛋白為特征的廣譜蛋白水解酶，是一種肽鏈內切酶[1-2]，廣泛存在于動物胰臟和微生物類群中，細菌、真菌、放線菌中均存在。彈性蛋白酶是一種經濟價值較高的酶制劑[3-4]。彈性蛋白酸作為一種水解專一性較廣的內肽酶，對很多蛋白質均有水解能力[5]。當彈性蛋白與其他蛋白共存時，它會優先水解彈性蛋白，彈性蛋白酶可作為理想的肉類嫩化劑應用于食品工業和日常生活中[6-7]。此外，彈性蛋白酶還可應用于農副產品深加工、高蛋白食品制作、罐頭工業，也可作為益生菌保健食品的促菌劑和嬰兒食品的強化劑[8-10]。胰臟是彈性蛋白酶的主要來源，由于臟器資源不足，胰彈性蛋白酶一直供不應求。由微生物發酵生產彈性蛋白酶成本低、產量大、設備利用率高，且不受原料來源的限制；因此，利用微生物發酵生產彈性蛋白酶是一條有效途徑。目前，由微生物發酵法生產彈性蛋白酶，關鍵在于篩選到產彈性蛋白酶的高產菌株。本研究首次從西藏自治區不同海拔地區的屠宰場附近采集土樣，并從中分離得到產堿性彈性蛋白酶的菌株XZJ4，結合生理生化特征和16S rDNA，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

1材料與方法

1.1樣品采集

選取西藏自治區林芝市、拉薩市、日喀則市、阿里地區4個不同海拔地區的屠宰場，在其附近的土樣中采集樣品共30份。

1.2主要試劑

pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶 HindⅢ、T4DNA連接酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司。小量PCR產物試劑盒購自Omega Bio Tek公司。其他試劑均為進口或國產分析純。

1.3培養基

培養基的配制參照文獻[11]。

1.4培養方法

種子斜面及平板培養均于37 ℃下培養24 h。進行復篩發酵培養時，將20 mL發酵培養基加入250 mL三角瓶中，接種后置于旋轉式搖床，于32～37 ℃、180 r/min條件下發酵培養24 h。

1.5粗酶制備[12]

將細菌發酵液以10 000 r/min離心10 min，收集去菌體發酵液進行硫酸銨分級鹽析（30%～65%飽和度），將沉淀溶于0.05 mol/L、pH值9.0的硼酸緩沖液中即為粗酶液。

1.6酶活力的測定

采用分光光度法[13]測定彈性蛋白酶活力。稱取10 mg剛果紅-彈性蛋白溶于1 mL水中，加入1 mL適當稀釋的酶液以及1 mL pH值7.4的0.2 mol/L硼酸緩沖液，于37 ℃下振蕩反應30 min；加入2 mL pH值6.0的0.7 mol/L磷酸鈉緩沖液終止反應，過濾后取上清液，于波長495 nm處測定光密度，采用蒸餾水替代酶液的反應體系為空白對照。在此反應條件下，溶解1 mg剛果紅-彈性蛋白底物所需的酶量定義為1個彈性蛋白酶活力單位（U）。

1.7菌落形態觀察及生理生化特征

菌體形態特征觀察和生理生化鑒定的方法主要參照文獻[14-16]。

1.8XZJ4菌株的分子生物學鑒定

采用16S rDNA寡核苷酸通用引物：P1，5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；P2，5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應按以下擴增程序進行：96 ℃預變性1 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共30個循環；72 ℃ 延伸10 min。PCR產物經電泳檢測后，將剩余的PCR產物純化，連接到pMD18-T載體，委托上海鼎安生物科技有限公司完成。采用Blast在線軟件對測序結果進行相似性分析，構建系統進化樹。

2結果與分析

2.1枯草芽孢桿菌的篩選

通過對30個樣品進行混合富集培養、彈性蛋白平板初篩、分離純培養，獲得180株產堿性彈性蛋白酶的菌株。對彈性蛋白水解圈與菌落直徑之比（H/C）較大的90株菌株進行搖瓶復篩，得到1株酶活力最高的菌株，編號為XZJ4，酶活為33 U/mL。

2.2菌株XZJ4的形態和生理生化特征

2.2.1形態特征將菌株XZJ4接種于彈性蛋白培養基上，于30 ℃下倒置培養48 h，形成蛋白水解圈（圖1）。圖1顯示，該菌株菌落呈圓形、乳白色、不透明，隆起度較高。顯微鏡下形態見圖2，為革蘭氏陽性桿菌，大小（寬×長）為（1.0～1.4） μm×（2.0～2.4） μm，兩端鈍圓，單個排列或短鏈狀排列。芽孢橢圓位于菌體中央，有鞭毛，無莢膜。

2.2.2生理生化特征由生理生化特征試驗結果（表1）可知，菌株XZJ4葡萄糖產酸、水解淀粉、木糖產酸、L-阿拉伯糖產酸、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、接觸酶、甘露醇產酸試驗為陽性，葡萄糖產氣、厭氧生長、吲哚、丙二酸鹽、卵黃卵磷脂酶試驗為陰性，這與已報道的枯草芽孢桿菌具有相同或近似的生理生化特征[17-18]。

表1菌株XZJ4的生理生化特征

特征試驗結果葡萄糖產酸+水解淀粉+木糖產酸+L-阿拉伯糖產酸+檸檬酸鹽利用+硝酸鹽還原+接觸酶+甘露醇產酸+葡萄糖產氣-厭氧生長-吲哚-丙二酸鹽-卵黃卵磷脂酶-注：“+”為陽性，“-”為陰性。

2.3菌株XZJ4的分子生物學鑒定

利用P1、P2引物擴增16S rDNA區域，片斷大小約為 1 500 bp（圖3），與預期相符。將產物進行凝膠電泳檢測，純化后連接pMD18-T載體，篩選出的陽性轉化子委托上海鼎安生物科技有限公司完成。

將測序結果在GenBank的Blast上進行比對，擴增片段與GenBank上報道的枯草芽孢桿菌（Bacillus substilis，GenBank登錄號NBRC13719）16S rDNA的同源性達100%，與枯草芽孢桿菌（GenBank登錄號JCM1465）16S rDNA的同源性達99%。序列采用Blast軟件與數據庫中已知的16S rDNA進行相似性比對，應用ClustalX軟件對目的序列進行比對和聚類分析，使用MEGA 6.06生物軟件構建進化樹（圖4）。

系統進化樹結果表明，XZJ4菌株屬于芽孢桿菌屬，與模式菌株枯草芽孢桿菌親緣性最近。

3結論與討論

選取西藏自治區不同海拔地區的屠宰場，在其附近的土樣中采樣30份樣品。通過混合富集培養、彈性蛋白平板初

篩、分離純培養獲得180株產堿性彈性蛋白酶的菌株，對彈性蛋白水解圈與菌落直徑之比（H/C）較大的90株菌株進行搖瓶復篩，得到1株酶活力最高的菌株，編號為XZJ4，酶活為 30 U/mL。結合生理生化和16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。本研究為進一步篩選高產堿性彈性蛋白酶菌株及其工業化發酵奠定了基礎，下一步可通過克隆該菌株的彈性蛋白酶基因構建基因工程菌，以期為西藏自治區本土堿性彈性蛋白酶的工業化發酵生產提供依據。

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