產幾丁質酶側孢短芽孢桿菌M64的產酶條件優化及部分酶學性質研究

劉蒲臨++程德勇++繆禮鴻

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.135

摘要：在紫外誘變的基礎上，采用單因素試驗和正交試驗對側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus） M64發酵生產幾丁質酶的培養條件和培養基進行優化，并對粗酶液的酶學特性進行了初步研究。結果表明，碳氮源的種類與濃度、培養溫度、pH值以及表面活性劑吐溫80濃度對該菌株產幾丁質酶有顯著影響。突變株使用優化后的培養條件，其發酵上清液中幾丁質酶活力達到55.19 U/mL，為未優化前的2.56倍；粗酶液最適催化溫度為60 ℃，且在80 ℃預處理2 h后仍具有降解幾丁質的能力，表現出了良好的熱穩定性。

關鍵詞：側孢短芽孢桿菌；幾丁質酶；產酶條件；酶學性質

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0468-04

收稿日期：2015-09-29

基金項目：國家“863”高技術研究發展計劃（編號：2013AA102805）；武漢輕工大學科研啟動經費（編號：2014RZ19）。

作者簡介：劉蒲臨（1985—），男，湖北武漢人，博士，講師，主要從事環境微生物學研究。Tel：（027）83956793；E-mail：liunan3585@163.com。

通信作者：繆禮鴻，博士，教授，主要從事資源與環境微生物學研究。Tel：（027）83956793；E-mail：miaowhpu@126.com。幾丁質是由幾丁質合酶以尿嘧啶二磷酸-N-乙酰葡糖胺為前體，催化N-乙酰葡糖胺以β-1，4糖苷鍵相連形成長鏈后，不同長鏈之間以反平行（α型）或平行（β型）的方式相互作用所形成的[1]。幾丁質是構成絲狀真菌和擔子菌細胞壁的主要成分，同時廣泛存在于節肢動物外骨骼和甲殼綱動物的外殼中[2]。據統計，自然界中每年產生的幾丁質超過100億t，是僅次于纖維素的第二大有機物[3]。

幾丁質酶可以催化幾丁質的水解，廣泛存在于微生物和高等動植物體內[4]。微生物所產生的幾丁質酶除了可以水解幾丁質獲取營養、賦予細菌競爭或寄生優勢以外，還可以降解真菌細胞壁和昆蟲幾丁質外殼，進而應用于植物的病蟲害防治[5]。此外，幾丁質降解所形成的幾丁寡糖具有抗菌、調節免疫力和抗癌等功效，在功能食品和保健藥品等方面具有廣闊的應用前景[6-7]。因此本研究以前期篩選得到的具有幾丁質降解能力的側孢短芽孢桿菌M64為出發菌株，通過紫外誘變和正交試驗等手段提高和優化其發酵產酶能力并研究了粗酶液的部分酶學性質，為進一步研究開發其所產幾丁質酶提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

側孢短芽孢桿菌M64，由筆者所在課題組前期篩選得到。幾丁質粉末購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2試驗方法

1.2.1膠體幾丁質制備將10 g幾丁質粉末加入100 mL濃鹽酸中，磁力攪拌2 h后室溫靜置24 h。將幾丁質的酸溶液轉移至1 L蒸餾水中，攪拌均勻。5 000 g離心10 min收集膠體幾丁質沉淀。使用蒸餾水反復沖洗至pH值為6.5左右。最終使用200 mL蒸餾水重懸沉淀，獲得5%的膠體幾丁質母液。

1.2.2培養基配制（1）菌體擴增與計數培養基：牛肉膏蛋白胨培養基。（2）初始發酵培養基，在Hoster等所使用培養基配方[8]基礎上有所更改：膠體幾丁質 5.0 g/L，酵母膏 2.0 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，CaCl2·2H2O 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L。（3）突變株篩選培養基：初始發酵培養基中添加瓊脂至濃度為15.0 g/L。

1.2.3幾丁質酶酶活測定使用DNS法（3，5-二硝基水楊酸比色法）[9]，以β-D-N-乙酰氨基葡萄糖繪制標準曲線，分別對待測樣品以及樣品空白進行測定。將1 min產生相當于1 μmol β-D-N-乙酰氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量定義為1個活力單位（U）。

1.2.4紫外誘變與突變株篩選將出發菌株接種至50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養 10 h。離心收集菌體，使用50 mL無菌生理鹽水進行重懸，平板計數法測定菌懸液濃度。轉移5 mL菌懸液至無菌培養皿中，在距離40 W紫外燈50 cm處，分別處理15～105 s。紫外照射完畢后，進行平板菌落計數，并按照以下公式計算致死率：

致死率=（照射前菌懸液濃度-照射后菌懸液濃度）/照射前菌液濃度×100%。

觀察并測定菌落在膠體幾丁質固體培養基上所形成的水解圈大小。挑取水解圈較大的單菌落接種至初始發酵培養基中，測定發酵液中幾丁質酶的酶活。

1.2.5培養條件優化以初始發酵培養基為基礎，通過單因素試驗分別考察pH值、培養溫度、培養時間和吐溫80濃度對發酵液中幾丁質酶活力的影響。

1.2.6培養基優化通過單因素試驗確定不同培養基成分對發酵液中幾丁質酶活力的影響，選取影響較大的因素進行正交試驗，確定M64產幾丁質酶的最佳培養基構成。

1.2.7粗酶液酶學性質研究（1）最適溫度和pH值的測定：分別于20～80 ℃以及pH值為3.0～10.0條件下測定發酵上清液中幾丁質酶的活性。（2）熱穩定性的測定：將發酵上清液置于20～80 ℃下水浴 2 h 后檢測酶活。

2結果與分析

2.1紫外誘變與突變株篩選

2.1.1紫外致死曲線菌株M64的紫外致死曲線如圖1所示。當紫外處理時間為15 s時，菌體致死率為9.02%。隨著處理時間延長至60 s，菌體致死率增長至87.22%。當紫外處理時間大于75 s時，菌體致死率已接近100%。本試驗選擇致死率在80%～90%的紫外線劑量，確定誘變所使用照射時間為60 s。

2.1.2紫外誘變后菌株的篩選經過紫外誘變的菌懸液經梯度稀釋后涂布于含有1%膠體幾丁質的固體培養平板上，避光培養72 h后觀察透明圈產生情況。測量并計算透明圈直徑（H）與菌落直徑（C）的比值，從中挑選出比值較大的單菌落完成初篩。將比值較大的10株突變株分別劃線純化，培養形成種子液后以1%接種量接種至初始發酵培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養36 h，使用DNS法測定發酵液中幾丁質酶活力。突變株篩選結果如表1所示。其中，菌株 M64-7幾丁質酶活力最高，達到32.30 U/mL，為野生型菌株的1.50倍。突變株M64-7經過多次劃線傳代后酶活力保持穩定，具有較好的遺傳穩定性，故以突變株M64-7進行后續相關試驗。

2.2突變株培養條件的優化

2.2.1培養時間對幾丁質酶產量的影響將過夜培養的突變株M64-7的菌液以1%接種量接種于初始發酵培養基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養，每隔6 h測定發酵液中幾丁質酶活和菌體生長量。圖2表明，菌株M64-7在36 h產酶達到最大值，36 h與42 h幾丁質酶活差異不顯著。發酵液酶活變化曲線與菌體生長情況表現出了良好的一致性。

2.2.2培養溫度與起始pH值對幾丁質酶產量的影響將突變株M64-7的種子液以1%接種量接種至不同pH值或不同培養溫度的初始發酵培養基中進行振蕩培養（180 r/min），36 h后測定發酵液中的幾丁質酶活力。圖3表明，該菌株在初始pH值為7.0以及培養溫度為37 ℃時，產酶達到最高水平。

2.2.3吐溫80含量對幾丁質酶產量的影響表面活性劑能增強細胞膜的通透性，從而提高幾丁質酶產量。將非離子表面活性劑吐溫80添加至初始發酵培養基中，至終濃度分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%。在最適pH值和培養溫度下培養36 h后，發酵上清液中的酶活如圖4所示。當吐溫濃度小于0.2%時，發酵液酶活隨著吐溫80濃度的增大而增強；吐溫80濃度為0.2%時，發酵液酶活達到最大值。因此，本研究最終選擇培養基中的吐溫80濃度為0.2%。

2.3不同的培養基成分對發酵液中幾丁質酶產量的影響

2.3.1氮源種類與濃度對幾丁質酶產量的影響以初始發酵培養基為基礎，在其他成分不變的條件下，分別添加不同濃度的酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl以及KNO3，比較不同氮源對幾丁質酶產量的影響。在相同接種量和培養條件下，以有機物作為氮源有助于幾丁質酶產量的提高，當培養基中含有8.0 g/L的酵母膏時，發酵液中幾丁質酶活力達到 49.68 U/mL（圖5-a）；而向培養基中添加無機氮（NH4Cl與KNO3）不會顯著影響幾丁質酶的產量（圖5-b）。

2.3.2碳源種類與濃度對幾丁質酶產量的影響在培養基中其他成分不變的條件下，分別添加不同濃度的膠體幾丁質、葡萄糖和蔗糖，比較不同碳源對幾丁質酶產量的影響，結果如圖6所示。膠體幾丁質含量由0.5%增加至2.5%時，幾丁質酶產量先逐漸增加后趨于平緩，說明該菌株幾丁質酶的表達受到外源幾丁質的誘導；但當培養基中不含膠體幾丁質時，幾丁質酶仍有部分表達（圖6-a）。以葡萄糖或蔗糖作為碳源時，發酵液中幾丁質酶含量明顯下降（圖6-b）。

2.3.3緩沖鹽濃度對幾丁質酶產量的影響將初始發酵培養基中的磷酸鹽濃度定義為100%，調整培養基中磷酸鹽相對濃度至25%～200%不等，比較不同緩沖鹽濃度對幾丁質酶產量的影響，結果如圖7所示。培養基中緩沖鹽濃度為初始培養基緩沖鹽濃度的50%～125%時，單位體積發酵液所表現出的幾丁質酶活力穩定在較高水平；低于或高于該濃度范圍均使幾丁質酶的產量有所下降。

2.3.4培養基成分的正交優化根據單因素試驗的結果，選擇酵母膏作為氮源，膠體幾丁質作為碳源和緩沖鹽濃度一起進行正交試驗，確定最佳培養基配方。菌體的發酵均在最佳培養條件下進行（含0.2%吐溫80），結果如表2所示。使用SPSS 10.0對數據進行處理后，發現在α=005的顯著性水平上酵母膏和膠體幾丁質的濃度變化顯著影響了幾丁質酶的產量（P<0.05）；而培養基中的緩沖鹽濃度的變化對幾丁質酶產量的影響不顯著。此外，極差（R）結果表明，酵母膏濃度對幾丁質酶產量的影響較大?？疾焐鲜?個因素在4個水平上的變化之后，得出最佳產酶培養基成分為：酵母膏 6.0 g/L，膠體幾丁質含量 2.0%，緩沖鹽濃度為初始發酵培養基的50%。經重復試驗驗證，使用該配方后，菌株M64-7酶活穩定在（55.19±0.48） U/mL。

2.4溫度與pH值對發酵液中幾丁質酶活力的影響

溫度與pH值對幾丁質酶活力的影響如圖8所示。發酵液最適催化溫度為60 ℃；當反應溫度為80 ℃時，酶活為最高值的41.17%（圖8-a）。圖8-b表明，發酵液在pH值為70時表現出了最高酶活力。為了進一步研究幾丁質酶對高溫的耐受能力，將發酵液分別置于20～80 ℃預處理2 h，在60 ℃以及pH值=7.0的條件下測定殘余的酶活力，結果（圖8-c）表明，經過60 ℃預處理后，其酶活力沒有受到顯著影響；當預處理溫度提高至80 ℃時，其酶活力仍為原來的3775%，具有較強的熱穩定性。

3討論與結論

側孢短芽孢桿菌在自然界中常常定殖于水體、土壤以及昆蟲的體表，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目的多種昆蟲以及一些線蟲具有殺滅作用；該菌還產生與拮抗性有關的酶和抗生素，抑制多種病原細菌或真菌的生長[10]。幾丁質酶已被證明是微生物產生真菌拮抗能力的重要原因之一，然而國內尚未對側孢短芽孢桿菌中幾丁質酶的產量及其影響因素展開研究。因此，本試驗以前期所篩選的側孢芽孢桿菌M64為基礎，通過紫外誘變提高其產酶能力，并探索其產酶的最佳條件與影響因素。該菌株產幾丁質酶的最佳培養溫度為37 ℃，最佳酸堿度為pH值=7.0。培養基中碳源和氮源的種類與濃度對幾丁質酶的產量有顯著影響。膠體幾丁質可以誘導幾丁質酶的表達，葡萄糖等速效碳源對幾丁質酶的產生有明顯的抑制作用。 有機氮源濃度的提高也有助于菌體合成并分泌幾丁質酶。當發酵培養基中酵母膏濃度由2 g/L提高至8 g/L時，發酵液中幾丁質酶的含量提高了31%。經過紫外誘變與培養條件優化之后，突變株發酵液酶活達到55.19 U/mL，為初始野生型菌株的2.56倍。酶學分析表明，菌株M64-7發酵液中幾丁質酶的最適反應溫度為60 ℃，80 ℃預處理2 h仍具有37.75%的催化活性。Karthik等研究指出，微生物幾丁質酶的最適反應溫度主要介于40～60 ℃之間，耐受溫度平均在50 ℃左右[11]。因此，M64-7所分泌幾丁質酶的耐熱性處于較高水平。綜上所述，本研究探索了影響側孢短芽孢桿菌產幾丁質酶的幾個營養因素，并顯著提高了幾丁質酶的產量，為該菌株在幾丁質廢棄物生物轉化以及生物拮抗方面的推廣與應用奠定了良好的基礎。

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