水環境中乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻的致毒脅迫效應

王洪斌++趙鑫++金雪萍++肖龍海++韓雪++李士虎

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.134

摘要：以江蘇省連云港市海州灣常見海洋微藻塔胞藻（Pyramidomonas delicatula）、巴夫藻（Pavlova viridis）為試驗材料，研究水環境中乙草胺對2種海洋微藻的致毒脅迫效應。以葉綠素a含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量為指標，研究2種海洋微藻的生長量及細胞內抗氧化系統對乙草胺致毒脅迫的響應。結果表明：塔胞藻、巴夫藻2.5 mg/L試驗組培養至7 d，生長量分別為對照組的6.4%、6.0%；96 h培養時間內，乙草胺對塔胞藻及巴夫藻葉綠素a含量的影響表現在降低葉綠素a的合成量，2.5 mg/L試驗組葉綠素a的含量分別為對照組的26%、28%；乙草胺對2種微藻的SOD活性均表現誘導性上升，1.0 mg/L試驗組達最高值，是對照組的158倍；塔胞藻、巴夫藻0.5 mg/L試驗組CAT活性達最高值，分別是對照組（0 mg/L）的1.5、1.4倍；2種微藻體內MDA含量隨乙草胺處理濃度增加而明顯提高，塔胞藻、巴夫藻在2.5 mg/L試驗組達最高值，均為對照組15倍以上。一定濃度的乙草胺對塔胞藻及巴夫藻具有強烈的致毒脅迫效應，不同海洋微藻對乙草胺致毒脅迫的響應存在種屬差異性。

關鍵詞：乙草胺；塔胞藻；巴夫藻；致毒效應

中圖分類號： TQ450.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0465-03

收稿日期：2015-08-06

基金項目：國家級高等學校大學生創新創業訓練計劃（編號：201411641049Y）；江蘇省海洋資源開發研究院開放課題（編號：JSIMR201319）

作者簡介：王洪斌（1966—），男，江蘇連云港人，碩士，教授，研究方向為環境微生物生物技術。E-mail：lygwhbly@126.com。乙草胺是一種廣泛使用的選擇性酰胺類芽前除草劑，主要適用于防除禾本科雜草和闊葉雜草，它能被雜草的幼芽和幼根吸收，抑制雜草蛋白質合成而使雜草死亡[1-3]。由于酰胺類除草劑具有較高的水溶性及相對較低的土壤吸附常數，施用到農田的乙草胺容易通過滲透轉移到淺層地下水或隨雨水徑流而造成水體污染，直接或間接對人體健康造成危害[4]。而乙草胺是我國使用最多的3種除草劑（甲草胺、乙草胺和丁草胺）之一[5]，所以乙草胺使用后在環境中的歸宿及殘留污染對人和動物的毒性成為學者關心的熱點。

浮游藻類具有取材方便、易于培養和操作的特點，對化學污染物的致毒脅迫敏感，浮游藻類受殘留污染物致毒脅迫而產生活性氧自由基，能夠引發一系列氧化應激反應，產生有毒代謝產物，對生物體的細胞造成損傷，最終導致細胞死亡[6]。由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等組成的抗氧化系統能夠有效防御活性氧自由基的侵害。丙二醛（MDA）產生與脂質過氧化程度相關，可以指示細胞機體受到氧化損傷的程度[7-9]。研究表明，許多農藥能夠抑制生物體內抗氧化酶的活性，導致生物體內活性氧自由基含量的增加，對生物體構成氧化脅迫。目前，國內外關于農藥殘留污染的研究主要集中在它們對水生生物的急性毒性效應[10]，而乙草胺對海洋微藻抗氧化酶活性影響的研究尚屬空白。本研究以江蘇省連云港市海州灣常見海洋微藻塔胞藻（Pyramidomonas delicatula）、綠色巴夫藻（Pavlova viridis）為試驗材料，研究水環境中乙草胺對2種微藻的致毒脅迫效應。以葉綠素a含量、超氧化歧化酶活性、過氧化氫酶活性及丙二醛含量為指標，研究2種海洋微藻的生長及細胞內抗氧化系統對乙草胺致毒脅迫的響應，旨在提示農藥污染對水環境破壞的嚴重性，揭示海洋微藻作為環境毒理學評價指標的潛在應用，并為乙草胺的合理安全使用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

塔胞藻、綠色巴夫藻均為淮海工學院海洋學院海藻實驗室保存種。微藻培養液采用f/2加富海水，海水采自連云港市連島海域（鹽度3.10%～3.20%）漲潮時，醋酸纖維薄膜過濾，121 ℃滅菌20 min待用。

乙草胺（濟南天邦化工有限公司生產的50%乳油）用蒸餾水稀釋為500 mg/L，備用。

1.2方法

1.2.1微藻培養方法藻種在f/2培養液中培養到指數生長期為接種物。微藻培養采用f/2海水培養液，不通氣靜止培養，在無菌條件下將20 mL處于指數生長期的藻種接種于裝有180 mL f/2培養液的500 mL錐形瓶中，光照度為 3 000 lx，光—暗周期12 h—12 h，每天定時搖動3次，（23±1）℃下培養[11]。

1.2.2微藻生長測定取培養至4 d的藻液100 mL，分別加入0、100、200、300、400、500 μL乙草胺溶液，使乙草胺濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L。采用吸光度法定時對其生長進行測定。以接種時間為初始時間開始測定，每天定時取出5 mL藻液。以未接任何藻種的f/2加富海水營養液為空白對照，在波長680 nm下測定其D680 nm值，連續7 d[12]。試驗設3個平行組。

1.2.3葉綠素a測定采用丙酮提取法。取培養96 h的藻液10 mL，5 000 r/min離心10 min，收集藻泥，加3 mL 80%丙酮，凍融3次，超聲波破碎細胞、離心，上清液即為葉綠素a提取液[13]。

1.2.4SOD活性、CAT活性、MDA含量檢測試驗根據南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。所有試驗均重復3次，數據取平均值，并分析其差異顯著性。

2結果與分析

2.1乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻生長特性的影響

由圖1可見，處理組塔胞藻在培養3 d后，表現出強烈抑制效應，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L組培養7 d，D680 nm分別只有對照組的24.0%、18.0%、10.0%、7.4%、6.4%。由圖2可見，低濃度的乙草胺（≤1.0 mg/L）對綠色巴夫藻生長脅迫作用不明顯，在培養3 d后，生長水平與對照組（0 mg/L）相比，表現出抑制效應，0.5、1.0 mg/L組培養7 d后，分別是對照組的69%、70%；而1.5、2.0、2.5 mg/L 組表現出強抑制效應，培養7 d后分別是對照組的10.0%、6.0%、6.0%。乙草胺濃度高于0.5 mg/L，對2種微藻表現出明顯抑制作用，說明高濃度的乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻具有強烈的致毒效應。試驗還證實，不同濃度乙草胺對不同微藻生長的脅迫作用存在差異。

2.2乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻葉綠素a合成的影響

乙草胺對塔胞藻及綠色巴夫藻葉綠素a的影響主要表現在降低葉綠素a的合成量，呈現明顯的劑量效應（圖3）。培養至96 h，與對照組相比，試驗組塔胞藻及綠色巴夫藻葉綠素a的含量均隨濃度增加而降低，塔胞藻較綠色巴夫藻下降幅度尤為明顯，塔胞藻0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 試驗組，葉綠素a含量分別為對照組的59%、50%、37%、30%、26%，經分析，0.5、1.0 mg/L組與對照組差異顯著（P<0.05），而其他各試驗組與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。綠色巴夫藻0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L試驗組葉綠素a含量分別為對照組的77%、65%、38%、31%、28%，經分析，0.5、1.0 mg/L 組與對照組差異不顯著，而其他各試驗組與對照組比較有極顯著差異（P<0.01）。2種微藻比較可知，低濃度乙草胺對塔胞藻的葉綠素a合成致毒脅迫效應遠大于綠色巴夫藻，高濃度乙草胺對葉綠素a合成的影響趨向一致，與“2.1”節所述的生長狀況結論是一致的，不同微藻對農藥致毒脅迫的響應存在較大的種屬差異性。

2.3乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻SOD活性的影響

乙草胺處理2種微藻96 h后SOD活性變化見圖4，可見低濃度乙草胺對2種微藻的SOD活性均表現誘導性上升。塔胞藻在1.0 mg/L試驗組達最高值，是對照組的1.58倍，差異極顯著（P<0.01）；隨乙草胺質量濃度加大，SOD活性逐漸下降，2.5 mg/L試驗組恢復至對照組水平。綠色巴夫藻也在 1.0 mg/L 試驗組達最高值，是對照組的1.81倍，差異極顯著（P<0.01）；后緩慢降低，與塔胞藻類似，在2.5 mg/L乙草胺處理下恢復至對照組水平。

2.4乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻CAT活性的影響

圖5顯示乙草胺處理2種微藻96 h后CAT活性變化情況，可見塔胞藻0.5 mg/L試驗組CAT活性達最高值，是對照組（0 mg/L）的1.5倍；隨乙草胺濃度的進一步上升而下降，2.5 mg/L 試驗組CAT活性是對照組的95%，基本恢復至對照組水平。綠色巴夫藻也在0.5 mg/L試驗組CAT活性達最高值，是對照組的1.4倍；2.5 mg/L試驗組CAT活性是對照組的94%，基本恢復至對照組水平。各試驗組與對照組比較，差異性均不顯著。

2.5乙草胺對塔胞藻、綠色巴夫藻MDA含量的影響

圖6顯示，96h培養時間內，2種微藻體內MDA含量隨

乙草胺處理濃度增加而明顯增高，2種微藻在0.5 mg/L試驗組與對照組（0 mg/L）相比即大幅度升高，且隨乙草胺質量濃度加大而明顯增加；在2.5 mg/L試驗組達最高值，為對照組15倍；綠色巴夫藻在1.5 mg/L時MDA含量就高達對照組15倍，后增長趨勢平緩，2.5 mg/L試驗組也達最高值，為對照組16倍，差異性均為極顯著（P<0.01）。MDA含量反映機體受過氧化損傷程度，塔胞藻、綠色巴夫藻對乙草胺致毒脅迫的響應存在差異。2種海洋微藻MDA含量變化與其生長特性的響應是一致的。

3討論

農作物施用農藥和沿海一些農藥生產廠的排污已對近海水域構成污染，目前，農藥殘留污染對海洋生物資源、養殖生態環境的破壞性影響已引起廣大學者的高度重視。因此監測海洋農藥殘留污染對保護海洋生物資源及生態修復具有重要意義，本研究用乙草胺殘留污染對海洋微藻的致毒脅迫效應進行初步研究，探討其對海洋微藻毒性效應，為農業生產上合理、安全使用酰胺類除草劑提供理論依據。

本研究以江蘇省連云港市海州灣常見藻種塔胞藻、綠色巴夫藻為供試藻，實驗室條件下研究乙草胺致毒脅迫對2種海洋微藻生長、抗氧化系統及葉綠素a合成的影響。試驗證實，高濃度乙草胺具有強烈的毒性效應，從對葉綠素含量影響情況看出，乙草胺對綠色巴夫藻的致毒脅迫效應遠大于塔胞藻，與對其生長特性脅迫影響的結論一致，不同微藻對農藥致毒脅迫的響應存在較大的種屬差異性。乙草胺對海洋微藻的毒性影響遠大于另一種除草劑草甘膦[14]。

SOD和CAT活性是好氧生物抗氧化機制的主要活性酶，其活性變化可以反映微藻抵御污染物脅迫能力[15]。本研究顯示，低濃度乙草胺對2種微藻的SOD活性均有誘導性刺激上升作用，反映微藻受乙草胺氧化脅迫，機體抗氧化能力增強，而后隨乙草胺濃度增加逐漸下降，在質量濃度1.0 mg/L時，SOD活性達最高，在質量濃度 2.5 mg/L 時恢復至對照組水平，沒有出現抑制效應，與劉霞等結論[16]不一致，至于多少質量濃度的乙草胺能誘導機體產生過量的超氧陰離子自由基，超出機體的清除能力而導致藻體暴發性死亡，有待進一步研究。對CAT活性表現趨勢同SOD。MDA是生物膜中多種不飽和脂肪酸在活性自由基攻擊后產生的過氧化產物，其含量高低反映藻細胞膜過氧化損傷程度，2種MDA含量反應與其生長特性的響應一致，96 h培養時間，隨乙草胺處理濃度加大，MDA含量顯著增加，表明微藻體內活性自由基積累，脂質過氧化產物增加，有毒代謝產物大量積累，MDA含量與污染物的濃度呈正相關，與劉霞等試驗結果[16-17]一致。

本研究沒有涉及其他環境因素，對于乙草胺致毒效應機制以及微藻的種屬差異、微藻的適應機制等需要進一步深入研究。

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