熱脅迫對轉TasHSP16.9擬南芥幼苗生長生理特性的影響

李靜婷++趙旭耀++劉超凡++秦永興

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.027

摘要：首先研究小麥16.9 ku小分子熱激蛋白（small heat shock protein，簡稱sHSP）基因（sHSP16.9）3′-UTR中微型反向重復轉座元件（miniature inverted-repeat transposable elements，簡稱MITE）插入對基因表達調控的影響，結果顯示：熱脅迫下，具有MITE插入的基因型中sHSP16.9基因轉錄水平較無MITE插入的基因型明顯提高，而MITE是一類特殊的DNA介導的轉座子，推測其參與基因表達調控。隨后研究MITE參與基因表達調控的機制，構建2種不同的植物表達載體pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9、pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9+MITE轉化擬南芥，結果顯示：sHSP16.9+MITE超表達的轉基因擬南芥中，sHSP16.9基因表達量較sHSP16.9超表達的轉基因擬南芥明顯提高；高溫脅迫下，sHSP16.9+MITE超表達的轉基因擬南芥中種子發芽率、幼苗存活率、游離脯氨酸含量均較sHSP16.9超表達的轉基因擬南芥明顯提高，而丙二醛含量升高的幅度明顯低于sHSP16.9超表達的轉基因擬南芥。由結果可知，sHSP16.9+MITE超表達的轉基因擬南芥耐熱性水平較sHSP16.9超表達的轉基因擬南芥高，推測sHSP16.9基因3′-UTR中MITE插入增強該基因的表達。

關鍵詞：MITE；TasHSP16.9；3′-UTR；擬南芥；基因調控；小麥；耐熱性；生理指標

中圖分類號： S188；Q786文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0113-03

收稿日期：2016-03-28

基金項目：國家自然科學基金（編號：31501310）；平頂山學院高層次人才科研啟動項目（編號：2011015G）。

作者簡介：李靜婷（1983—），女，內蒙古包頭人，博士，講師，主要從事小麥遺傳育種學研究。E-mail：jingting_lee@163.com。在熱脅迫條件下，高等植物中誘導合成大量熱激蛋白，最豐富的為小分子熱激蛋白（small heat shock protein，簡稱sHSP）。進一步研究發現，高等植物中的sHSP還可在其他環境脅迫條件（如低溫、重金屬、高鹽、干旱等）下誘導合成，而在正常生長環境條件下表達量很低，表明sHSP可能在植物耐脅迫方面發揮重要作用[1-2]。同時，大量研究表明，將sHSP基因轉入植物體后，可以顯著提高植物的耐熱性。Sanmiya等將番茄線粒體sHSPs基因轉化煙草，顯著提高了煙草的耐熱性[3]；張路等用灰巖皺葉報春sHSP17-1基因轉化擬南芥，轉基因擬南芥耐熱能力明顯提高[4]。熱脅迫影響植物的形態結構和生理功能，發芽率、幼苗存活率、丙二醛（MDA）含量、游離脯氨酸含量等指標均能在一定程度上反映植物對高溫的抗性水平。

微型反向重復轉座元件（miniature inverted-repeat transposable elements，簡稱MITE）是一類特殊的DNA介導的轉座子，經常插入到基因的編碼區、內含子、啟動子、非翻譯區（UTR）而與基因緊密相關。但是，關于MITE插入與基因表達二者之間本質關系的研究還比較少[5-9]。筆者所在課題組前期研究中通過單倍體分析發現，小麥中存在2種單倍型的sHSP16.9基因，即在sHSP16.9基因3′-UTR存在1個 276 bp MITE的插入/缺失。克隆2種單倍型小麥的sHSP169基因全長進行比對分析發現，啟動子區僅有單堿基突變差異，對關鍵順式作用元件并無影響，主要差異在于3′-UTR內 276 bp MITE的插入/缺失。在高溫、低溫脅迫條件下，具有MITE插入的基因型中sHSP16.9基因轉錄水平較無MITE插入的基因型顯著提高[10]。進一步分別構建2種不同的植物表達載體pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9、pCAMBIA Super-1300+sHSP16.9+MITE轉化擬南芥，經潮霉素篩選和PCR檢測，獲得轉基因擬南芥T3代純系[11]。

本試驗利用已篩選獲得的2種不同植物表達載體轉化的擬南芥純系進行熱脅迫處理，測定種子發芽率、幼苗存活率、丙二醛和游離脯氨酸含量等生長生理指標，分析2種類型轉基因植株的耐熱能力，進而推測MITE對sHSP16.9基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料

供試品種是轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥純系、轉sHSP16.9基因擬南芥純系，由筆者所在課題組前期篩選獲得；此外還有哥倫比亞野生型擬南芥（WT）。

1.2方法

1.2.1轉基因擬南芥植株熱脅迫條件的設定將轉基因擬南芥種子用5%次氯酸鈉溶液（含體積分數0.1%的 TritonX-100）處理5 min進行表面消毒，用蒸餾水沖洗6遍。4 ℃春化處理3 d后，將轉基因擬南芥種子播種于含 25 μg/mL 潮霉素的MS培養基上，在溫室中培養，光—暗周期為16 h—8 h，晝—夜溫度周期為22 ℃—18 ℃，濕度60%。培養10 d后選取長勢好的幼苗移栽到營養土中，培養4周后，選取生長一致的轉基因植株進行42 ℃高溫脅迫處理，處理時間分別為2、4、8、12、24 h，光—暗周期為16 h—8 h。分別以2種供試類型的正常生長條件轉基因擬南芥植株為對照，每個處理組進行3次獨立的生物學重復試驗。

1.2.2種子萌發的熱脅迫處理將消毒處理后的轉基因、野生型擬南芥種子春化處理3 d后，在48 ℃水浴中處理2、3、4、5 h，分別播種在含25 μg/mL潮霉素及普通MS培養基上，于光照培養箱中培養，2周后觀察種子的萌發情況，拍照并統計種子的萌發率。

1.2.3幼苗的熱脅迫處理將消毒、春化處理后的轉基因、野生型擬南芥種子分別播種在含25 μg/mL潮霉素及普通MS培養基上，在組培瓶中培養3周后，對轉基因、野生型擬南芥幼苗進行獲得耐熱性檢測，即首先在38 ℃預處理2 h，隨后轉移至45 ℃致死高溫下分別處理1、2、3 h。處理后的擬南芥仍放回光照培養箱中恢復生長6 d，觀察表型并且拍照統計成活率。

1.2.4生理指標測定取上述熱脅迫處理的轉基因、野生型擬南芥植物的葉片進行生理指標測定，每個樣品平行測定3次，取平均值。MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[12-13]測定；游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸提取比色法[12-13]測定。試驗數據利用Excel 2007、SPSS 18.0進行分析。

2結果與分析

2.1轉基因擬南芥中sHSP16.9的表達模式

對轉基因擬南芥T3代純系進行半定量分析發現，sHSP16.9+MITE超表達的轉基因擬南芥中sHSP16.9基因表達量較sHSP16.9超表達的轉基因擬南芥明顯提高（圖1）。推測sHSP16.9基因3′-UTR中MITE插入增強了sHSP16.9基因的表達。

2.2熱脅迫對種子萌發的影響

分別統計處理不同時間點的種子萌發率，由表1可以看出：在48 ℃熱脅迫下，擬南芥種子的萌發受到破壞或抑制，隨著熱激處理時間延長，種子萌發率逐漸下降，在熱激處理5 h后，2種類型轉基因、野生型擬南芥種子都未萌發；在同一熱激處理時間點，轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥種子萌發率最高，轉sHSP16.9基因擬南芥次之，WT的萌發率最低。本試驗結果表明，sHSP16.9超表達能明顯提高轉基因擬南芥的耐熱性，而且sHSP16.9+MITE超表達的轉基因擬南芥較sHSP16.9超表達的轉基因擬南芥耐熱性高。結果同時也表明，轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥中sHSP16.9基因表達量較轉sHSP16.9基因擬南芥明顯提高。

2.3熱脅迫對幼苗的影響

分別統計處理不同時間點的幼苗存活率，由表2、圖2可以看出：隨著45 ℃熱激處理時間延長，擬南芥植株成活率逐漸下降；45 ℃致死高溫處理3 h，野生型擬南芥幼苗已完全白化、死亡，轉基因擬南芥部分幼苗也出現白化，部分幼苗葉片大面積出現黃綠色，但仍然能夠生長，轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥幼苗成活率最高。本試驗結果表明：sHSP16.9超表達能明顯提高轉基因擬南芥的耐熱性，而且轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥耐熱性較轉sHSP16.9基因擬南芥明顯提高；同時表明，轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥中sHSP16.9基因表達量較轉sHSP16.9基因擬南芥明顯提高。

2.4熱脅迫對轉sHSP16.9基因擬南芥生理指標的影響

2.4.1高溫脅迫下丙二醛含量的變化由圖3可以看出，在高溫脅迫下，2種類型轉基因擬南芥葉片中MDA含量均明顯增加，都明顯高于相應對照；但是轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥中葉片MDA含量在各處理時間點都低于轉sHSP16.9基因擬南芥，表明轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥的膜脂過氧化作用較小，因而具有更強的耐熱能力。

在熱脅迫前4 h，2種類型轉基因擬南芥葉片MDA含量均升高，可能是由于高溫造成植物體內的自由基代謝平衡失調、MDA積累；熱脅迫8 h，MDA含量均迅速下降，可能是擬南芥內源熱激蛋白被誘導大量表達，協助熱變性的蛋白進行正確折疊，并保護細胞膜結構的穩定性，導致MDA含量均迅速下降；隨后MDA含量均迅速上升，可能由于擬南芥誘導產生的內源熱激蛋白開始降解，膜脂過氧化程度加劇，膜脂過氧化產物MDA含量迅速上升。

2.4.2高溫脅迫下游離脯氨酸含量的變化由圖4可以看出，高溫脅迫會使擬南芥葉片游離脯氨酸含量明顯提高，都明顯高于對照水平，但轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥中葉片游離脯氨酸含量在各處理時間點上都高于轉sHSP16.9基因擬南芥。可見轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥對高溫脅迫有更積極的響應和應對，表現出較強的耐熱性。在前4 h的熱處理中，轉sHSP16.9基因擬南芥葉片游離脯氨酸含量緩慢提高，2種類型轉sHSP16.9基因擬南芥差異不明顯；但是在熱處理4 h以后，2種類型轉sHSP16.9基因擬南芥葉片游離脯氨酸含量迅速提高，且差異明顯，可能是擬南芥內源熱激蛋白被誘導大量表達，提高了細胞穩定性，促使合成大量游離脯氨酸，從而提高了細胞的耐熱性。

3討論與結論

小麥是我國重要的糧食作物，在農業生產中具有重要地位，但是隨著工業經濟的迅速發展，溫室氣體大量排放，全球溫度逐漸上升，嚴重影響了小麥的正常生長發育。由于干熱風的影響，一般年份小麥減產10%～20%，嚴重年份減產30%以上。為此，我國育種學家一直致力于小麥耐熱品種的選育和相關耐熱基因的功能研究。

在逆境下，植物細胞內氧自由基平衡遭到破壞，發生膜脂過氧化作用，而丙二醛是膜脂過氧化的主要產物，可以反映細胞膜的損傷程度，丙二醛含量越高，說明質膜受損越嚴重。因此，逆境下的丙二醛含量可以顯示質膜受損程度，反映植物的耐性大小。大量研究表明，在高溫脅迫下，植物體內丙二醛含量顯著增加，但是耐熱品種中丙二醛含量低于熱敏感品種[14-15]。在熱脅迫下，報春PFsHSPs17-1轉基因擬南芥葉片中丙二醛含量上升幅度低于野生型對照，表現出較高的抗膜脂過氧化能力，因而具有更強的高溫適應能力[4]。

在高溫脅迫下，植物為防止細胞脫水而受害，會生成并積累大量滲透調節物質，提高原生質親水性，有助于細胞持水，保護細胞膜的完整性。游離脯氨酸便是一類重要的滲透調節物質，因此可作為植物抗逆性的一項生化指標。大量研究表明，在高溫脅迫下，細胞內游離脯氨酸含量會明顯增加，以增強植物的耐熱性[15-16]。在高溫脅迫下，報春PFsHSPs17-1轉基因擬南芥葉片中游離脯氨酸含量明顯高于野生型對照，轉基因擬南芥對高溫脅迫有更積極的響應，表現出較強的耐熱性[4]。

在本試驗中，轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥葉片中丙二醛含量上升幅度低于轉sHSP16.9基因擬南芥，而前者游離脯氨酸含量、種子發芽率和幼苗成活率均明顯高于后者，表明轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥具有更強的耐熱性。同時研究表明，將sHSP轉基因超表達后，可以顯著提高植物的耐熱性[3-4]。也證明轉sHSP16.9+MITE基因擬南芥中sHSP16.9表達量高于轉sHSP16.9基因擬南芥，進而推測sHSP16.9基因3′-UTR中MITE插入增強了sHSP16.9 基因的表達。同時，本試驗中轉sHSP16.9基因擬南芥種子發芽率、幼苗成活率均明顯高于野生型擬南芥，證明sHSP對提高植物耐熱性具有重要的作用，為小麥耐熱性育種研究提供了新思路。

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