不同生長年限園參根的雙向電泳分析

麻銳++馮凱++姜銳++陳偉++靳雯棋++徐曉浩++畢英飛++孫立偉

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.019

摘要：為了解園參根在生長過程中的蛋白質組學變化，利用雙向電泳技術分離1～5年園參根蛋白，重點分析園參根生長（3年）、成熟（5年）之間的蛋白質組學差異，并利用MALDI-TOF/TOF鑒定差異顯著的81個蛋白點。結果表明：有19個差異蛋白點在成熟期表達量下調，62個蛋白點表達量上調，針對其與園參根生長發育的潛在關系進行分類與討論；園參根在逐漸成熟的過程中與抗脅迫相關的過氧化氫酶、單脫氫抗壞血酸還原酶等，以及與能量代謝相關的ATP酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等表達量增加，而與生長相關的果膠酯酶表達量減少，這些蛋白質的變化對于探討人參根的生長發育規律有重要意義。

關鍵詞：園參；生長年限；雙向電泳；蛋白質組學

中圖分類號：S567.5+10.1文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2016）10-0084-04

收稿日期：2015-09-02

基金項目：國家自然科學基金（編號：81373932）；吉林省教育廳科學技術研究項目[編號：吉教科合字（2014）第193號]；吉林省科技計劃（編號：20150520138JH、20130522045JH、20140519016JH、YYZX201268）。

作者簡介：麻銳（1982—），女，吉林吉林人，博士，講師，主要從事人參蛋白質組學研究。E-mail：maruijilin@163.com。

通信作者：馮凱，碩士，講師，主要從事植物生物科學研究。E-mail：fengk544@163.com。人參（Panax ginseng C A May，Araliaceae）為五加科多年生草本植物，其根部作為補氣圣品，有悠久的藥用歷史。人參的品質多受其生長年限的影響，需要生長5年以上才可收獲藥用。研究表明，人參根中含有多種皂苷、揮發油、多糖、蛋白質等物質，具有調節中樞神經系統、促進大腦對能量物質的利用、改善心臟功能、降低血糖、增強人體免疫力、抗腫瘤等作用[1]，并且這些物質含量會隨著參齡的增長而遞增，進入成熟期（5年）后趨于穩定[2-3]。也就是說，進入成熟期的人參質量好，藥效價值顯著，并且在這過程中的生理生化轉變皆可由基因調控的蛋白質差異表達而得以反映。因此，研究人參根生長期與成熟期的蛋白質組學變化對于揭示人參生長發育特性有重要意義。

近年來，隨著蛋白質組學的快速發展，高通量、高靈敏度的雙向電泳和質譜等蛋白質組學技術已經可以快速鑒定上千種蛋白質，為監測植物生長代謝過程中蛋白質的動態變化提供了可能。本研究應用比較蛋白質組學技術，建立不同生長年限園參的蛋白質表達圖譜，分析其差異表達蛋白的功能，探討園參參根的生長發育規律，對認識園參藥效形成有一定意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

75株試驗樣品采自吉林省撫松縣露水河鎮，分別為1、2、3、4、5年生園參各15株。新鮮園參用超純水洗凈后，切成碎塊，用液氮研磨成精細粉末后存于-80 ℃備用。

1.2蛋白提取

園參根蛋白質的提取方法采用改進后的酚提法[4]。取0.2 g液氮研磨的園參根粉末，加入7倍體積、含0.07% β-巰基乙醇的丙酮溶液（-20 ℃預冷），-20 ℃靜置1 h后，于4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清，重復3次；將沉淀置于 4 ℃ ，待丙酮完全揮發后，加入4倍體積樣品裂解液{含 7 mol/L 尿素、2 mol/L硫脲、2% 3-[（3-單酰胺丙基）-二乙胺]-1-丙磺酸（CHAPS）、1%植物蛋白抑制劑}，旋渦混勻，100 W超聲40 min后，于15 000 r/min、4 ℃離心 15 min，收集蛋白上清液；加入等體積Tris-飽和酚（pH值=7.8）振蕩30 min，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取中層、下層，加7倍體積含0.1 mol/L乙酸銨的甲醇溶液沉淀過夜，于4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清；沉淀用含 0.1 mol/L 乙酸銨的甲醇溶液洗滌2遍，再用預冷的丙酮洗滌3遍，將沉淀物干燥，于-80 ℃貯存。參照Bradford的方法進行蛋白質定量[5]。

1.3雙向電泳（2-DE）

取1 000 μg蛋白，加入再水化液[含5 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、2% CHAPS、2%磺基三甲基胺乙內酯3-10（SB3-10）、0.65% pH值3～10固相pH值梯度緩沖液（IPG buffer）、0.35% pH值4～7固相pH值梯度緩沖液（IPG buffer）][6]至終體積450 μL。等電聚焦采用24 cm、pH值3～10預制干膠條（GE Healthcare），Ettan IPGPhorII等電聚焦儀（Amersham Biosciences）聚焦。聚焦程序：（1） 30 V 10 h；（2）200 V 2 h；（3）500 V 2 h；（4）1 000 V 2 h；（5）8 000 V 3 h；（6）8 000 V 72 000 V·h。等電聚焦完成后，將IPG膠條放入含有1%二硫蘇糖醇（DTT）平衡緩沖液[75 mmol/L Tris-HCl，pH值=8.8，6 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，30%甘油，2%十二烷基硫酸鈉（SDS），0.002%溴酚藍]中平衡15 min后，再將膠條置于含有2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液中平衡 15 min。最后采用12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠進行雙向電泳。

1.4圖像掃描及分析

凝膠經考馬斯亮藍染色后，使用掃描儀（Amersham Biosciences）進行圖像掃描，最后利用Image Master 2D Platinum Software Version 6.0（Amersham Biosciences）進行處理、分析（包括蛋白點的檢測、匹配等），找出各樣品凝膠的差異點。在3次重復試驗中確保差異點間體積變化均在1.5倍以上。

1.5蛋白質的鑒定

挖取差異蛋白點，分別轉入0.5 mL Eppendorf離心管中，通過復旦大學蛋白質組學實驗室的4 700串聯飛行時間質譜儀[4700 Proteomies Analyzer （TOF/TOFTM） （Applied Biosystems，USA）]進行MALDI-TOF-MS/MS鑒定，所得結果用GPS（Applied Biosystems，USA）-MASCOT（Matrix Science，UK）進行數據庫檢索。數據庫為NCBI綠色植物庫；檢索的方式為combined，即指紋圖譜和串級聯合檢索；最大允許漏切位點為1；酶為胰蛋白酶；質量誤差范圍設置：PMF，0.3 u；MS/MS，0.4 u。匹配肽段數目大于2的蛋白將被接受。最后利用NCBI和SWISS-PROT數據庫進行蛋白質功能的查詢。

2結果與分析

2.1不同年份園參根的蛋白質表達圖譜

本研究利用雙向電泳技術，重點分析成熟期（5年）、生長期（3年）園參的根蛋白質表達情況（圖1），每例樣品重復3張膠。本研究得到差異表達的81個蛋白點，它們在不同膠中的相對體積相差1.5倍以上。在5年園參根中有33個蛋白點（5T1～5T33）特異表達，29個蛋白點（5C1～5C29）表達量上調。3年園參根中有5個蛋白點（3T1～3T5）特異表達，14個蛋白點（3C1～3C14）表達量上調。

2.2差異表達蛋白的鑒定

研究表明，不同生長年限園參根的圖譜中蛋白質豐度發生改變。其中低豐度蛋白表達不同，而中、高豐度蛋白點分布很相似。有趣的是，在不同年限園參根圖譜中，20～30 ku區域內均有8個不同pI值的高豐度蛋白點，經MALDI-TOF/TOF MS分析，為類核糖核酸酶儲存蛋白（表1）。據報道，此高豐度蛋白的含量也會隨著季節的變化而變化[7]，是一類人參生長儲存蛋白，為人參在自然環境中生存提供能量。

通過搜索NCBI綠色植物蛋白質數據庫，從81個差異蛋白點中成功鑒定52個蛋白（鑒定率64.2%），鑒定結果見表1。

依據GO數據庫的描述，將成熟與生長期園參差異表達蛋白按其生物功能分為6類（圖2），其中與抗逆、能量代謝相關的蛋白在園參生長發育過程中表達差異明顯。

3結論與討論

蛋白質組學研究方法和技術的發展提供了一種從表達蛋白整體水平揭示生命活動規律的新策略和新思路，為認識園參生長過程中蛋白質組學的改變提供了強有力的研究手段。本研究通過比較不同生長年限園參根的差異表達蛋白，發現其中大多數蛋白質是與抗氧化、抗脅迫及能量代謝相關的酶，這提示園參根由生長到成熟的轉變過程中導致抗脅迫、能量代謝相關途徑發生改變。

3.1抗脅迫相關蛋白

園參根長年埋于地下，是發生抗逆反應的主要部位。為了對脅迫信號作出相應的應答，隨著參齡的增長，園參根內發生一系列抗逆相關蛋白表達上調，以適應不利的環境條件。差異表達中的過氧化氫酶（5T20～ST22） 在5年園參中特異表達。過氧化氫酶是生物體內主要的抗氧化酶類，催化細胞內過氧化氫的分解，從而使細胞免受過氧化氫的毒害[8]，保護人參免受氧化脅迫。此外還有一些抗逆相關蛋白表達上調，單脫氫抗壞血酸還原酶（5T15、5C22）在5年園參中也特異表達，它對于維生素C的再生具有重要作用[9]。內質網結合蛋白（5C35～5C37）屬于熱休克蛋白Hsp70亞家族，對于維持細胞穩態和防止細胞凋亡具有重要作用。在植物體內，內質網結合蛋白可能通過調控內質網上的未折疊蛋白應答、Ca2+信號反應等調節植物的抗旱澇脅迫能力[10-11]。在本研究中還發現一些參與次生代謝相關的酶，它們的表達也會受到脅迫反應的影響，如紫檀堿還原酶（5C17）、異黃酮還原酶（5C18）等在5年園參中表達量高于3年園參，提高了成熟園參的抗脅迫能力。更重要的是此類抗脅迫相關蛋白往往也具有藥效作用，如在腫瘤細胞中，內質網結合蛋白的產生與防止凋亡、免疫系統攻擊、抗腫瘤藥物耐藥性產生有關[12]。對此類蛋白的深入研究將為研究園參藥效形成機制提供理論依據。

3.2能量代謝相關蛋白

在成熟的園參根中不僅抗脅迫相關蛋白表達量上調，也伴隨著與能量代謝相關蛋白的表達差異。植物在抗脅迫過程中體內的代謝途徑會發生改變，與能量代謝相關的酶活性的提高可為有利于提高抗逆能力的物質合成提供能量（NADPH2、ATP）。能量代謝與抗脅迫過程的關系密不可分。ATP酶（5C11、5C16）是一種功能性蛋白，在5年園參中表達量上調，它與各種膜體系和細胞器有著廣泛聯系，同時在能量代謝、物質的吸收與運輸等生理功能上具有重要作用。研究表明，低溫脅迫會引起質膜ATP酶含量和活性的提高，從而釋放出更多能量（以熱能形式為主）來抵御低溫的侵襲[13]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（5T25、5C21）是糖酵解過程中的重要酶，參與糖酵解過程中第1個ATP的形成。近年來已發現，植物甘油醛-3-磷酸脫氫酶也可被鹽、旱、冷、熱、缺氧脅迫、缺鐵脅迫、植物激素、病菌侵染等多種環境脅迫所誘導表達，參與植物的抗脅迫反應[14]。同時，在本研究中還有一些與能量代謝相關的酶如蘋果酸脫氫酶（5T15、5C22）、磷酸甘油酸變位酶（5T7）、稀醇酶（5C13、5C15）等在5年成熟園參中表達量較高。

3.3生長發育相關蛋白

在差異表達蛋白中果膠酯酶（3C8）在3年園參中表達量上調，它作為催化果膠的甲氧酯水解產生果膠酸和甲醇反應的酶，普遍存在于高等植物的不同組織器官中，在細胞壁組成和降解、細胞游離、花粉發育、種子萌發、根尖延伸、種子開裂、果實軟化成熟、抗病等方面具有重要作用[15]。在根中，該酶與根邊緣細胞的啟動有密切的相關性，Wen等關于豌豆的試驗表明：果膠酯酶基因表達與根邊緣細胞發育有密切的正相關性[16]。本研究發現，果膠酯酶在園參生長階段的表達量要高于成熟園參，說明該酶在根的伸長過程中發揮著重要的生物學活性。

絲氨酸羥甲基轉移酶（5T18）存在于成熟園參根中，而在快速生長期其含量極低或檢測不到。絲氨酸羥甲基轉移酶在植物的一碳代謝和光呼吸中起著非常重要的作用。已有研究表明，在蘋果葉片中絲氨酸羥甲基轉移酶參與光合作用，促進葉片的生長，并且只存在于營養生長期的葉片中，而在幼年期的葉片和生殖生長期的葉片中含量極低或檢測不到[17]。成熟園參代謝能力增強，需要大量的一碳單位化合物用來合成多種產物，如DNA、RNA、輔酶、甲硫氨酸等，因此絲氨酸羥甲基轉移酶表達量增高。由于絲氨酸羥甲基轉移酶在植物中有多種重要而又普遍的生理功能，目前圍繞它的研究越來越多。

在園參生長發育的過程中，許多酶差異表達。在未來的研究中，以這些差異表達蛋白為研究對象，對認識園參根的生長發育規律、有效利用人參資源有重要意義。

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