海濱錦葵耐鹽基因KvSOS1的克隆與表達載體構建

王紅艷++王鴻磊

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.017

摘要：為了克隆鹽生植物海濱錦葵耐鹽基因KvSOS1并構建其表達載體，采用RT-PCR和RACE方法從海濱錦葵中克隆了質膜Na+/H+轉運蛋白基因KvSOS1（GenBank登錄號KJ577576）的全長cDNA序列，長度為3 850 bp，其中開放閱讀框長度為3 444 bp。KvSOS1基因編碼1個由1 147個氨基酸殘基組成的蛋白，分子量為127.56 ku，理論等電點pI為6.18。疏水性分析結果表明，該蛋白N-末端具有高度疏水性，并含有11個跨膜區，C-末端為1個長約700個氨基酸殘基的親水性尾巴位于細胞質中。KvSOS1基因編碼蛋白與雷蒙德氏棉、可可和陸地棉SOS1蛋白的氨基酸序列同源性很高，分別為86%、82%和82%。系統進化樹分析顯示KvSOS1基因編碼蛋白與質膜Na+/H+轉運蛋白、液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白（NHX）屬于不同分支。同時將KvSOS1基因構建入植物表達載體pBI121中，并成功轉入農桿菌LBA4404中。

關鍵詞：海濱錦葵；耐鹽基因；質膜Na+/H+轉運蛋白；表達載體

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0076-04

收稿日期：2015-08-14

基金項目：中國農業大學煙臺研究院校級項目（編號：YT201204）；國家自然科學基金（編號：41171216）。

作者簡介：王紅艷（1980—），女，河南安陽人，碩士，助理研究員，主要從事植物逆境生理及分子生物學方面的研究。E-mail：why1980221@163.com。

通信作者：王鴻磊，碩士，副教授，主要從事生化與分子生物學方面的研究。E-mial：whl197749@163.com。鹽脅迫是嚴重影響植物生長發育的主要非生物環境脅迫因素之一。土壤中Na+過高會擾亂植物正常的生理代謝活動，造成植物體內水分虧缺、離子平衡破壞，并引起氧化傷害等次生脅迫，從而導致植物生長受到抑制，甚至死亡[1-2]。植物抵御鹽脅迫的有效策略在于降低細胞質中Na+的含量，包括降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的區隔化[3-5]。目前，關于Na+的吸收機制尚不清楚，而Na+的外排和區隔化分別由位于細胞質膜和液泡膜上Na+/H+逆向轉運蛋白來調節。質膜型Na+/H+逆向轉運蛋白（SOS1）利用質膜上的P型 H+-ATPase建立的跨膜質子梯度作為驅動力，將胞內過量的Na+運出細胞以消除Na+的毒害，是目前發現的唯一一種介導Na+外排的質膜整合蛋白，在植物抵御鹽脅迫過程中發揮著關鍵作用[6]。

近年來，質膜Na+/H+逆向轉運蛋白（SOS1）在植物耐鹽性中的作用受到廣泛重視，許多植物的SOS1基因已被克隆和鑒定，包括甜土植物擬南芥、水稻、小麥、黃瓜等及鹽生植物鹽芥、鹽地堿蓬、獐茅等[7-13]。這些研究表明，鹽脅迫下SOS1能夠將Na+從根表皮及皮層細胞中排出胞外，降低Na+的積累。突變體功能互補試驗和過表達轉基因植株的耐鹽生理分析證實，SOS1可以恢復和提高轉化體的耐鹽能力[14-19]。由此可見，SOS1基因可用于植物耐鹽基因工程進行作物遺傳改良，是具有重要應用價值的耐鹽基因之一。

鹽生植物是生存于天然高鹽環境的植物群體，在長期的進化過程中形成了有效的鹽脅迫應答機制或調控途徑，是獲得耐鹽基因的好材料。因此，從鹽生植物中獲得SOS1等耐鹽基因并深入研究其鹽響應調控機制，對進一步了解植物耐鹽機制，獲得優質耐鹽基因意義重大。海濱錦葵（Kosteletzkya virginica L.）是分布于美國含鹽沼澤地帶的多年生鹽生植物，生長基質的含鹽量高達2.5%，是一種優良的耐鹽經濟作物和種質資源[20]。目前對海濱錦葵耐鹽性的研究主要集中在鹽脅迫對種子萌發和幼苗生長過程的生理特性變化方面，而對其耐鹽基因方面的研究很少[21]。本研究利用RT-PCR和RACE技術，克隆海濱錦葵KvSOS1基因，并對其進行生物信息學分析和構建植物表達載體，為該基因的深入研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料海濱錦葵種子，采自中國科學院煙臺海岸帶研究所山東省東營市試驗基地。

1.1.2菌株及質粒載體大腸桿菌DH5α、根癌農桿菌LBA4404及表達載體質粒pBI121為筆者實驗室保存；基因克隆載體pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 購自TransGen公司。

1.1.3主要試劑RNA提取試劑RNAiso Plus 購自TaKaRa公司；RACE試劑盒購自Clontech公司；限制性內切酶購自Thermo Scientific 公司；T4 DNA連接酶購自Promega公司；PCR mix、DNA Marker、反轉錄試劑盒、膠回收試劑盒和抗生素購自TransGen公司。引物合成和測序均由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.2試驗方法

1.2.1海濱錦葵幼苗培養及處理將海濱錦葵種子浸種、催芽后播種在含有干凈河沙的營養缽中，1/2 Hoagland營養液澆灌，放入人工氣候箱進行常規培養。待海濱錦葵長出4片真葉時，用含有200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營養液處理24 h，剪取幼苗根部用來提取總RNA。

1.2.2海濱錦葵總RNA的提取及第一鏈cDNA合成海濱錦葵總RNA的提取按照RNAiso Plus 說明書進行。用超微量分光光度計NanoDrop-2000c檢測所提總RNA的濃度和質量。以海濱錦葵總RNA為模板，按照TransGen公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 合成cDNA第一鏈。

1.2.3海濱錦葵KvSOS1基因全長cDNA的克隆利用GenBank上公布的陸地棉、可可、毛果楊、蓖麻等植物的SOS1基因的同源保守序列，設計1對簡并引物DP-F：5′-GG（A/G）GAATCCTT（A/G）ATGAA（C/T）GATGGG AC-3′，DP-R：5′-AC（T/C）A（G/A/T）AGC（G/A）CTTTCCTGCCA（C/T） AG-3′，以海濱錦葵cDNA為模板進行PCR擴增。將PCR擴增得到的目的片斷回收純化后與pEASY-Blunt Zero Cloning Vector連接并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，隨機挑取陽性菌落測序。對測序結果進行Blast在線分析，確認為SOS1基因的同源區段后，參照Clontech 公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification 試劑盒的操作方法，分別設計3′-RACE引物和5′-RACE引物，進行海濱錦葵KvSOS1基因3′和5′末端的擴增。將擴增得到的5′-RACE和3′-RACE片段分別進行克隆、測序后，與上述獲得的中間片段用DNAMAN軟件進行拼接，從而得到海濱錦葵KvSOS1基因的cDNA全長序列。

1.2.4海濱錦葵KvSOS1基因的生物信息學分析對海濱錦葵KvSOS1基因的cDNA全長序列用NCBI的ORF Finder識別開放閱讀框并翻譯成氨基酸序列；利用ExPAsy服務器上的ProtParam工具 （http：//web.expasy.org/protparam/）分析基因編碼蛋白的基本性質；利用在線工具 Conserved Domain Search Service（http：//www.ncbi.nlm.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析基因編碼蛋白的功能結構域；利用在線工具TMPRED （http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_ form .html） 進行基因編碼蛋白的跨膜預測和疏水性分析；利用在線Blast程序對基因核苷酸序列進行同源性分析，多序列比對分析采用ClustalX 2.1軟件；利用 MEGA 4.0 軟件中的 Neighbor-Joining法構建系統進化樹。

1.2.5海濱錦葵SOS1基因表達載體構建及鑒定根據獲得的海濱錦葵KvSOS1基因的cDNA序列及表達載體pBI121上的限制性酶切位點，設計包含完整編碼框并含有酶切位點的引物，以海濱錦葵總RNA反轉錄后的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶進行回收純化后連接pEASY-Blunt Zero Cloning Vector。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司測序。經測序驗證后的陽性克隆放大培養并提取質粒，通過雙酶切獲得帶有黏性末端的KvSOS1全長cDNA序列。然后與經過相同雙酶切的植物表達載體pBI121采用T4連接酶進行連接，將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含有卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆并進行菌液PCR和雙酶切驗證，最終獲得含有重組表達載體pBI121-SOS1的陽性克隆。隨后將該陽性克隆放大培養，提取重組質粒，采用凍融法將其轉入農桿菌LBA4404感受態細胞，在含有鏈霉素和利福平的YEB平板上篩選陽性克隆并進行菌液PCR驗證，對菌液PCR鑒定為陽性的克隆即可用于遺傳轉化。

2結果與分析

2.1海濱錦葵KvSOS1基因全長cDNA序列的獲得

使用簡并引物DP-F和DP-R進行RT-PCR擴增獲得約1 900 bp的cDNA中間片段。將該片段進行回收、克隆并測序，所獲得的核酸序列經Blast比對證實該片段與GenBank數據庫已知的SOS1基因同源序列具有較高的同源性。根據此片段序列設計特異性引物3′-GSP（5′-GTGCATCCAACTTTTAGTCATGGGAG-3 ′）和5′-GSP（5′-GCTATCC CAAAAGCA ATTCCAACCGC-3′），利用RACE技術獲得了海濱錦葵KvSOS1基因的3′末端和5′末端cDNA片段，分別進行回收、克隆、測序得到3′端和5′端片段的長度分別為1 375 bp和809 bp。將上述3個核苷酸序列拼接后，獲得了海濱錦葵KvSOS1的全長cDNA序列，其長度為3 850 bp，5′端和3′端分別存在93 bp和313 bp的非翻譯區，開放閱讀框長度為 3 444 bp。將該基因命名為KvSOS1，GenBank中登錄號為KJ577576。

2.2海濱錦葵KvSOS1基因編碼蛋白的生物信息學分析

海濱錦葵KvSOS1基因的開放閱讀框編碼1個由1 147個氨基酸殘基組成的蛋白，分子量為127.56 ku，理論等電點pI為6.18。利用NCBI的保守區搜索工具在線分析KvSOS1編碼的氨基酸序列，其N-末端具有NhaP、Na+/H+Exchanger、b_cpa1等保守結構域，C-末端有cNMP 、Crp等保守結構域，表明該基因屬于Na+/H+轉運蛋白家族成員（圖1）。用TMPRED軟件進行跨膜區預測和疏水性分析表明，該蛋白N-末端具有高度疏水性，并含有11個跨膜區，C-末端為1個長約700個氨基酸殘基的親水性尾巴位于細胞質中（圖2）。

同源性Blast比對結果表明，海濱錦葵KvSOS1編碼蛋白與多個物種編碼SOS1蛋白的氨基酸序列具高度同源性。如表1所示，同源性最高的是雷蒙德氏棉，同源性高達86%，與可可和陸地棉的同源性均為82%，與毛果楊、蓖麻、胡楊的同源性分別為74%、73%、72%。將以上植物的SOS1蛋白與海濱錦葵KvSOS1編碼蛋白進行多重序列比對發現，不同植物SOS1的N端跨膜區保守度較高，而C端相對較低。

系統進化樹分析顯示KvSOS1編碼蛋白與其他植物的質膜Na+/H+逆向轉運蛋白（SOS1）同屬于一個系統發育支，而與液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白（NHX）親緣關系較遠（圖3）。結果表明KvSOS1是編碼質膜Na+/H+逆向轉運蛋白的基因。

2.3海濱錦葵KvSOS1基因的植物表達載體構建與鑒定

通過對海濱錦葵KvSOS1基因的序列及表達載體pBI121上的限制性酶切位點分析，利用Primer 5.0、DNA Club等軟件設計了包含完整編碼框并含有酶切位點的1對引物：KvSOS1-F，5′-TCTAGAATGGAGGAACTGAAGGAGAATC-3′；KvSOS1-R，5′-GTCGACTCAAGAAGCTTGGTTGAATGAT-3′（劃線部分TCTAGA為XbaⅠ的酶切位點，GTCGAC為SalⅠ的酶切位點）。利用此對引物以海濱錦葵總RNA反轉錄后的cDNA為模板擴增KvSOS1基因的編碼區（圖4）。將目的條帶進行回收、純化、克隆，挑選陽性克隆測序后與之前獲得的全長cDNA序列進行比對，確定為目的基因KvSOS1。將該陽性克隆擴大培養并提取質粒，對質粒進行XbaⅠ和SalⅠ雙酶切消化處理后，獲得帶有雙酶切位點的目的片段，與經過同樣雙酶切的植物表達載體pBI121采用T4連接酶進行連接（圖5）。

將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含有卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆菌液PCR檢測表明陽性克隆中含有3.4 kb目的片段（圖6），然后將陽性克隆擴大培養并提取重組質粒pBI121-KvSOS1進行Xba Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切，結果顯示該質粒上含有3.4 kb目的片段（圖7）。這表明海濱錦葵KvSOS1基因已成功構建入植物表達載體pBI121中。

2.4重組植物表達載體轉化農桿菌LBA4404

采用凍融法將上述構建好的植物表達載體pBI121-SOS1轉化根癌農桿菌LBA4404感受態細胞，在含有鏈霉素和利福平的YEB 固體培養基上進行篩選。隨機挑取陽性克隆，以基因序列特異引物進行菌液PCR檢測，結果顯示PCR擴增產物均為 3.4 kb（圖8），證明植物重組表達載體 pBI121-SOS1已經成功轉入根癌農桿菌LBA4404中，此農桿菌可用于下一步的遺傳轉化。

3討論

在植物抵御鹽脅迫的過程中，質膜Na+/H+逆向轉運蛋白不僅參與植物根部的Na+外排，在維持細胞K+的穩態平衡、調節細胞內pH值和Ca2+轉運以及植物體內Na+的長距離運輸中也起著重要作用，對其進行深入系統地研究意義重大[22-23]。目前，對鹽脅迫條件下擬南芥中的SOS（Salt Overly Sensitive）信號通路研究得比較清楚[24-25]，在水稻和鹽芥中也發現了相似的SOS途徑[26]。在SOS途徑中，SOS1需經SOS2/SOS3蛋白激酶復合體磷酸化而激活其離子轉運活性，它是至今發現的唯一能把Na+從細胞內運輸到細胞外的膜運輸蛋白，與植物耐鹽性關系密切。大量研究證實，鹽脅迫可激活SOS1并誘導其基因上調表達，例如擬南芥、水稻、小麥、星星草、胡楊的SOS1基因均可被鹽脅迫誘導，上調它們的表達量。過量表達擬南芥、水稻、胡楊等的SOS1基因可提高轉化植物的耐鹽能力[15-19]。目前，已報道的不同植物中SOS1的結構同源性非常高，特別是N-末端的10～12個跨膜結構域非常相似，而C-末端的差異相對較大，這可能是不同植物中SOS1離子轉運活性響應逆境脅迫的差異所在。Takahashi等發現來源于耐鹽基因型蘆葦SOS1比鹽敏感基因型蘆葦SOS1能夠更有效地將Na+排出細胞，更大程度地提高轉基因酵母的耐鹽能力[27]。因此，從鹽生植物中發掘SOS1基因并對其進行深入研究對于獲得優良耐鹽基因資源和耐鹽基因工程具有重要的應用價值。海濱錦葵是一種具有多種經濟價值的鹽生植物，在長期適應環境的過程中，可能進化出獨特的離子調控機制，從中克隆質膜Na+/H+逆向轉運蛋白等耐鹽基因并深入研究其結構功能，對發揮其在鹽土農業及耐鹽工程育種等方面的作用具有重要意義。

4結論

本研究利用RT-PCR和RACE技術從海濱錦葵中首次克隆出該植物質膜Na+/H+轉運蛋白基因的全長cDNA序列，命名為KvSOS1，GenBank登錄號為KJ577576，全長為 3 850 bp，開放閱讀框長度為3 444 bp。生物信息學分析表明該基因屬于質膜Na+/H+轉運蛋白基因家族。同時，已將海濱錦葵KvSOS1基因構建入植物轉基因表達載體pBI121中，并成功轉入農桿菌LBA4404中。這為后續研究中將該基因轉化模式植物擬南芥以研究其功能以及耐鹽基因工程育種等方面奠定了重要的基礎。

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