4種玉米自交系幼胚遺傳再生體系的建立

楚海嬌++李闖+++關淑艷

摘要：選取4種玉米自交系H99、A188、7922和1322的幼胚作為外植體，接種于10種不同誘導培養基上，誘導愈傷組織并建立遺傳再生體系，同時探討了不同基因型、培養基種類、幼胚大小、蔗糖濃度、激素濃度和配比對愈傷組織誘導率的影響。結果表明：基因型對愈傷組織誘導率高低影響顯著，4種基因型玉米幼胚在誘導培養基中均產生了愈傷組織，但繼代培養后只有H99能誘導出胚性愈傷組織，誘導率為46.2%；對于不同基因型培養基誘導效果依次為N6>MB>MS；選擇幼胚長度為1.5～2.0 mm、添加蔗糖濃度為30 g/L、2，4-D濃度為2.0 mg/L及AgNO3濃度為 10 mg/L 時玉米愈傷組織誘導率最高且質量較好。

關鍵詞：玉米；再生體系；自交系；愈傷組織誘導率

中圖分類號： S513.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0066-03

收稿日期：2015-11-10

基金項目：吉林農業科技學院青年基金項目（編號：吉農院合字[2013]第210號）。

作者簡介：楚海嬌（1984—），女，吉林遼源人，碩士，助教，主要研究方向為玉米遺傳轉化。E-mail：chuhaijiao1227@163.com。

通信作者：關淑艷，博士，副教授，主要從事生物技術在作物遺傳育種中的應用研究。E-mail：fengrongl@163.com。我國是世界玉米大國，玉米作為重要的糧、飼作物對我國經濟發展和市場穩定具有舉足輕重的作用[1]。可以通過基因工程手段改良玉米的品種和農藝性狀，而建立高效的體細胞再生體系是遺傳轉化的關鍵。玉米優良基因型遺傳再生體系的建立一直是人們研究的熱點[2]。玉米首次誘導出愈傷組織是Larue在1949年用甜玉米的胚作為外植體，但未獲得再生植株。直到1975年，Green等用A188的未成熟胚作外植體，誘導出二倍體愈傷組織，并獲得再生植株，從而得到了第1株無性系植株[3]。目前，已能從多種外植體中誘導出愈傷組織，并再生植株。而以玉米幼胚為外植體進行培養，誘導愈傷組織的效率高、再生能力強，可大大提高育種效率。玉米組織培養的影響因素較為復雜，一些優良自交系的組織培養還存在一定困難。本試驗設計了10種不同誘導培養基對4種優良玉米自交系的愈傷組織進行誘導，并再生植株，目的是探尋出這4種玉米自交系遺傳再生體系建立的條件，為建立高效的玉米轉基因受體系統奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

優良玉米自交系H99、A188、7922和1322的幼胚。

1.2培養基

1.2.1誘導培養基本試驗設計了10種基本培養基進行愈傷組織的誘導研究（表1）。

1.2.2繼代培養基繼代培養基添加2，4-D的濃度為 1 mg/L。

1.2.3分化培養基分化培養基添加IBA 0.8 mg/L和 6-BA 1.5 mg/L。

1.2.4生根培養基生根培養基添加NAA 1.5 mg/L和活性炭1.5 g/L。

1.3方法

1.3.1玉米幼胚的剝離在超凈工作臺上對授粉13 d左右的幼胚進行消毒，沖洗。挑取不同大小的幼胚接種于誘導培養基上，每皿接種30個幼胚，25 ℃避光條件下培養15 d左右（其中經過2次去芽處理），產生Ⅰ型初始愈傷組織。篩選出淡黃色、顆粒狀、表面干燥的愈傷組織進行繼代培養、分化培養、生根培養及移栽。

1.3.2愈傷組織誘導率的計算公式如下：

愈傷組織誘導率=愈傷組織塊數/接種幼胚數×100%；

胚性愈傷組織誘導率=胚性愈傷組織塊數/接種幼胚數×100%。

2結果與分析

4種基因型玉米幼胚在最適培養基中均能產生初始愈傷組織。繼代培養后，自交系H99形成了松脆、淡黃色顆粒狀的Ⅱ型愈傷組織；自交系A188和7922的愈傷組織多為乳白色、硬殼狀，不易繼代；1322產生的愈傷組織結構松軟、黏稠狀，繼代后易褐變，后兩者為非胚性愈傷組織。

2.1基因型對誘導率的影響

基因型不同，愈傷誘導率存在差異[4]。繼代2～3次后，統計胚性愈傷組織誘導率。其中H99的誘導率最高，達462%，最低為A188，只有10.0%。隨著繼代次數的增加，只有H99能保持良好的生長狀態，形成結構松散的Ⅱ型愈傷組織；A188和7922逐漸褐化死亡；1322在繼代后多出現松軟黏稠狀的愈傷組織，誘導率下降（表2）。說明繼代中愈傷組織的生長對基因型的依賴性很強。

2.2培養基對誘導率的影響

分別采用3種基本培養基對玉米幼胚進行誘導，從表3中可以看出，采用不同的培養基，誘導情況差異顯著。使用N6培養基，4種基因型的誘導率均較高。但H99和1322在N6培養基中出愈率最高，分別為46.2%和26.7%；對于A188而言，最適培養基為MB；對于7922來說，N6和MB培養基均可誘導出愈傷組織，但胚性均不高；4種基因型在MS培養基中均誘導不出胚性愈傷組織。

2.3幼胚長度對誘導率的影響

有研究證明，基因型相同時幼胚大小對愈傷組織誘導率有影響[5]。本試驗挑取基因型H99和A188不同長度幼胚進行愈傷組織誘導發現：幼胚長度為2.0 mm時，愈傷組織誘導率最高，且生長良好；當幼胚長度小于1.5 mm時，愈傷生長緩慢，誘導率呈下降趨勢；當幼胚長度大于 2.0 mm 時，幼胚根芽分化現象比較嚴重，用鑷子將根芽夾去，可以提高幼胚出愈率（表4）。因此認為，幼胚長度為1.5～2.0 mm時較適宜接種。

2.4蔗糖濃度對誘導率的影響

在植物組織培養的培養基中，需要碳源為植物組織提供能量，實驗室多采用蔗糖作為碳源物質。因為蔗糖能更好地調節培養基內的滲透壓，同時在一定程度上能減少微生物的污染。

本試驗選用4種蔗糖濃度梯度對基因型H99和A188進行誘導。由表5可見，蔗糖濃度為30 g/L時玉米愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導率都較高。蔗糖濃度增大，愈傷組織逐漸變成白色而死亡；蔗糖濃度越小，愈傷組織由于滲透壓過低會出現水漬化狀態，胚性愈傷率降低。

2.5不同激素濃度及配比對誘導率的影響

激素的選擇影響愈傷組織的生成[6]。本試驗研究了生長素2，4-D、細胞分裂素6-BA和AgNO3的不同濃度、不同配比對愈傷組織誘導的影響。

生長素是愈傷組織生長的必需激素，2，4-D能誘發細胞分裂活性，引起細胞脫分化和無序增殖，產生愈傷組織，2，4-D濃度會影響愈傷組織的生長狀態。由表6可以看出，H99和1322在N65中誘導率最高，且生長狀態最好，認為2，4-D濃度為2 mg/L時較適宜；品種7922的最適2，4-D濃度為 1 mg/L；而A188的最適2，4-D濃度為3 mg/L。黃璐等研究認為，2，4-D濃度過大對愈傷組織有傷害作用，在組培過程中會增加無性系變異[7]。而2，4-D濃度過低會導致愈傷組織生長緩慢或者死亡。

誘導培養基中添加AgNO3可以提高胚性愈傷誘導率和植株再生率。1988年，Songstad研究發現向N6或MS培養基中添加AgNO3，可提高Ⅱ型愈傷組織的誘導率及植株再生率[8]。由表6可以看出，H99、7922和1322在N65培養基中的胚性誘導率均較高，說明誘導培養基中添加AgNO3能夠提高胚性誘導率；而在N66培養基中，H99和1322誘導率明顯降低，說明添加10 mg/L AgNO3+0.5 mg/L 6-BA的配比對愈傷組織誘導沒有促進作用。

2.6愈傷組織的繼代培養

繼代培養過程中，非胚性愈傷組織并不能長期繼代生長。研究發現，基因型A188和7922在繼代過程中色澤逐漸變暗，停止生長；基因型1322繼代培養一段時間后呈愈傷黏稠狀組織并逐漸褐化死亡，這可能受到基因型限制或者所用培養基及激素濃度配比使用不當造成。而H99在繼代中大部分生長良好。通過繼續培養發現，添加1.0 mg/L的2，4-D有利于愈傷組織保持其胚性。

3結論與討論

本試驗以優良玉米自交系H99、A188、7922和1322在授粉10～15 d的幼胚作為受體材料，在最適誘導條件下誘導胚性愈傷組織，并再生成完整植株。同時對以幼胚為外植體誘導愈傷組織的幾個重要影響因素進行研究，得出以下結論：初步誘導時，4種基因型玉米幼胚在誘導培養基中均產生了愈傷組織；繼代培養后，只有H99產生了淡黃色、顆粒狀并且生長迅速的Ⅱ型胚性愈傷組織，另外3種玉米基因型沒有誘導出胚性愈傷組織。

雖然玉米愈傷組織誘導具有普遍性，但是誘導率受多種因素影響，如基因型、培養基成分、激素濃度、幼胚大小以及人為因素等[9-10]。誘導過程中基因型對愈傷組織的質量和出愈率有較大影響[11]，本試驗的4種玉米自交系中，H99的誘導率最高，為46.2%，其次是1322和7922，A188最低，為10%。因此，在進行玉米幼胚遺傳再生體系建立時，選擇易于培養的材料是至關重要的[12]。

對于不同基因型愈傷組織的誘導，要選擇適宜培養基進行培養，本試驗采用3種基本培養基的誘導效果依次為N6>MB>MS。對于一些玉米基因型，雖然愈傷初始誘導率較高，但在長期繼代培養過程中胚性很難保持，使得植株再生率降低，原因可能與繼代培養基不適宜或者人為操作不當有關，對此還需要進一步研究。同時也充分說明植株再生率與出愈率之間沒有相關性，這與孫紅煒等在影響玉米愈傷組織誘導和植株再生的有關因素中的研究[13]相符。

本研究未涉及光照、溫度等培養條件對玉米幼胚誘導的影響[14]，并且對于繼代、分化和生根培養基未進行優化研究。因此本研究結果是否具有廣泛適用性，還需進一步研究驗證。

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