A64治療裸鼠肝癌移植瘤超早期改變的IVIM-DWI研究

徐笑雙，馬榮，張冬，史長征，夏明翰，邢會杰，陳敏鋒，羅良平*

腫瘤新生血管為腫瘤的生長提供大量的氧氣和營養物質，是腫瘤增殖、轉移的基礎，直接破壞腫瘤組織中的新生血管能夠抑制腫瘤生長以及引起腫瘤細胞缺氧壞死[1]。A64是由暨南大學藥學院自主研發的一種長春新堿衍生物，是新型的血管破壞劑(長春堿類衍生物及其制備方法和應用。國際PCT專利，申請號：PCT/CN 2014/000192)。基于擴散加權成像(diffusion weighted imaging，DWI)技術的體素內不相干運動(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像技術在提供組織內水分子真實擴散特征的同時，可在不注射對比劑的情況下無創、定量地反映組織內的灌注改變，在活體上可用于腫瘤內水分子的擴散、血流灌注信息進行動態、定量監測。本實驗利用IVIM-DWI技術對A64治療裸鼠肝癌皮下移植瘤的超早期療效進行動態監測與定量評估，并結合病理組織學與免疫組化結果，探討A64治療后腫瘤超早期的病理生理改變與IVIM參數的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及腫瘤模型

使用人肝癌Huh7細胞株。健康BALB/C nu/nu，鼠齡4～5 w，雌性，體重14～16g。將1×107個/mL密度的肝癌細胞按0.2 mL/只的量接種于裸鼠腹側后肢根部皮下。常規飼養，直至瘤塊直徑約1 cm左右，建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型。所有動物實驗有關的操作程序均得到暨南大學實驗動物使用與倫理管理委員會批準。選取成功建模后成瘤裸鼠22只，將其隨機分為影像檢查組和平行病理組，每只裸鼠一次性尾靜脈給藥A64 (2 μmol/kg)。

1.2 MR檢查及數據后處理

影像檢查組10只，分別給予基線、給藥后1 h、2 h、4 h、24 h 5個時間點進行體素內不相干運動彌散成像，動態測量D*值、f值、D值，在24 h點掃描完畢后全部處死取腫瘤組織。每只裸鼠在掃描前尾靜脈注射0.3%戊巴比妥進行麻醉。MR檢查采用美國GE公司的Signa 1.5T MR掃描儀，動物線圈，頭先進，仰臥位，將移植瘤的中心定位于線圈及磁體的中心。掃描序列：常規快速自旋回波序列(fast spin echo，FSE)的T1加權像，參數：TE=14.7 ms，TR=540 ms，層厚2 mm，層間距0.2 mm，FOV=5 cm×5 cm，矩陣192×160，NEX=2?？焖倩謴妥孕夭?fast recovery fast spin echo，FRFSE)的T2加權像，相關參數：TR=2140 ms，TE=82.3 ms，層厚2 mm，層間距0.2 mm，FOV=5 cm×5 cm，矩陣256×192，NEX=2。IVIM-DWI檢查序列：TR=4200 ms，TE=101.7 ms，矩陣96×128，層厚2 mm，層間距0.2 mm，FOV=7.0 cm×5.6 cm，共13個b值，分別為0、25、50、75、100、150、200、400、600、800、1000、1200、1500 s/mm2，對應的NEX分別為1、2、2、3、3、3、4、4、4、6、6、8、10，擴散梯度分別施加于X、Y、Z 3個方向。

后處理在GE公司提供的ADW 4.5圖像后處理工作站進行，觀察常規序列 T1WI、T2WI圖像，根據經典雙指數模型對原始圖像進行分析得到D*值、f值及D值。感興趣區(region of interest，ROI)的選擇是在IVIM-DWI序列上腫瘤最大層面及其上、下兩個相鄰層面，盡量避開血管及壞死區域，在實性部分放置大小25～30 mm2的圓形ROI，測量3個平面的ROI取平均值。

IVIM-DWI的計算公式：Sb/S0=(1-f)×exp(-b×D)+f×exp [-b (D+D*)]，S代表體素內的信號強度，D代表體素內真性擴散系數，D*為假性擴散系數，f是灌注分數[2]。

1.3 病理組織學及CD31免疫組化分析

平行病理組12只，分別對應影像檢查組的基態及給藥后各時間點處死3只取腫瘤組織，其中24 h時間點的3只從影像檢查組的10只中隨機選取。取出處死裸鼠的瘤體，妥善固定，進行常規HE染色、CD31染色。在鏡下觀察腫瘤體積、瘤內細胞密度、壞死及腫瘤血管形態、數量等定性指標。利用ipp6軟件對CD31進行腫瘤血管密度的定量檢測，計算指標為高倍視野下(×200)腫瘤內CD31平均累積光密度值，計算公式：平均累積光密度值=陽性染色細胞累積光密度值/(陽性染色細胞面積+陰性染色細胞面積)。

1.4 統計學分析和相關性檢驗

應用SPSS 19.0 統計軟件對所得數據進行統計學分析，采用GraphPad Prism 6.0進行統計圖的繪制。定量資料以表示，實驗組D值、D*值、f值和病理組CD31平均累積光密度值計數各時間點采用重復測量方差分析，各時間點測量值前后的兩兩比較采用配對t檢驗，結果以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

成功建模22只裸鼠，掃描前、后實驗動物一般情況無明顯異常。

2.1 常規MRI結果

常規MRI表現與基態相比，給藥后不同時間點腫瘤大小未見明顯變化。給藥后1 h在T2WI上腫瘤內可見極少量小斑片狀低信號和高信號，隨著時間的推移至給藥后24 h，腫瘤高、低信號稍增多，信號略混雜，T1WI上腫瘤信號均無明顯變化。

2.2 影像檢查組IVIM-DWI結果

組內各時間點樣本的正態性檢驗：由于樣本量小于50，采用Shapiro-Wilk進行正態性檢驗，結果顯示，D、D*、f、CD31-IOD值4項指標0～24 h各時間點P值均大于0.05，說明數據服從正態分布。

D值在給藥后2 h內明顯下降，4～24 h腫瘤D值逐漸上升恢復至基態水平，且以腫瘤周邊D值升高為著。重復測量方差結果顯示，D的F時間為8.110，P=0.000，說明給藥前后不同時間點D值差異有統計學意義(P＜0.05) (見表1和圖1、2)。

D*值在給藥后1～4 h進行性下降，24 h回升。重復測量方差結果顯示，D*值的F時間為12.860，P=0.000，說明給藥前后不同時間點D*值差異有統計學意義(P＜0.05) (見表1和圖1、2)。

f值在給藥后2 h、4 h有所降低，24 h上升。重復測量方差結果顯示，f值的F時間為4.580，P=0.005，說明給藥前后不同時間點f值差異有統計學意義(P＜0.05) (見表1和圖1、2)。

D值各時間點比較，基態與4 h、24 h，1 h與4 h，4 h與24 h之間差異沒有統計學意義，P分別為0.211、0.955、0.326、0.107；基態與1 h、基態與2 h、1 h與2 h、1 h與24 h、2 h與4 h、2 h與24 h之間差異有統計學意義，P值分別為0.000、0.000、0.042、0.011、0.022、0.002。

D*值各時間點比較，1 h與4 h、1 h與24 h和2 h與4 h差異沒有統計學意義，P值分別為0.051、0.744、0.583；基態與1 h、2 h、4 h、24 h，1 h與2 h、2 h與24 h、4 h與24 h差異有統計學意義，P值分別為0.002、0.001、0.002、0.016、0.016、0.012、0.015。

f值各時間點比較，基態與1 h、2 h、24 h和1 h與24 h、2 h與4 h差異沒有統計學意義，P值分別為0.741、0.121、0.285、0.426、0.209；基態與4 h、1 h與2 h、1 h與4 h、2 h與24 h、4 h與24 h差異有統計學意義，P值分別為0.046、0.037、0.005、0.018、0.020。

2.3 平行病理組結果

HE染色：與基態相比，給藥后1 h腫瘤內壞死不明顯，細胞數量仍較多，排列密集。2 h開始腫瘤內壞死增多，組織結構紊亂。4 h及24 h時，壞死、出血范圍進一步擴大，以中央為著，腫瘤周邊可見部分細胞增殖。高倍鏡下4 h、24 h腫瘤內新生血管逐漸增多(圖3)。

表1 IVIM-DWI序列各參數均數及標準差(n=10)Tab.1 The mean value and standard deviation of each IVIM-DWI parameter

圖1 IVIM-MRI各定量參數(D、D*及f值)的箱式圖。中間橫線代表中位數，箱子兩端代表上四分位數 圖2 尾靜脈注射A64前及注射后各時間點腫瘤IVIM-DWI序列相關參數偽彩圖。給藥后1 h、2 h腫瘤的D值明顯下降，4 h、24 h回升接近基態，以腫瘤周邊明顯。D*值在給藥后4 h內逐漸下降，24 h轉為升高。f值4 h內有所降低，24 h轉為上升，變化不明顯Fig.1 The box diagram of D, D* and f. The middle lines represent the medians, and both ends of the boxes represent the quartile. Fig.2 The colour map of IVIM-DWI parameters at each time point before and after caudal vein injection of A64. D value decreases apparently at 1 h and 2 h after injection, and rises to baseline at 4 h, 24 h, especially by the surrounding of the tumor. D* value decreases gradually at 4 h and rises at 24 h as well as f value, but the change is not evident.

CD31血管染色：給藥1 h腫瘤血管即出現形態失常，管腔狹窄，血管數量尚無明顯變化；2 h時血管破壞明顯，管腔閉塞，內皮細胞固縮，血管數量稍減少；4 h血管破壞更加明顯，腫瘤周邊可見少量新生血管，這些血管由單層內皮細胞圍成，結構簡單；24 h腫瘤周邊出現更多的新生小血管，相較于基態，瘤體內血管數量有所增加(圖3)。

CD31-IOD在給藥后2 h持續減少，4 h起明顯增加，且超過基態水平。0 h、1 h、2 h、4 h、24 h的CD31染色平均IOD值(×100)分別為0.94±0.37、0.53±0.08、0.49±0.17、1.09±0.27、1.34±0.35。重復測量方差分析結果顯示IOD值的F時間=11.525，P=0.000，說明給藥前后不同時間點CD31-IOD值差異有統計學意義。

CD31-IOD值各時間點前后比較，基態與4 h、基態與24 h、1 h及2 h、4 h及24 h的變化沒有統計學意義，P值分別為0.174、0.151、0.569、0.273；基態與1 h，基態與2 h、1 h與2 h、1 h與4 h、1 h與24 h、2 h與4 h、2 h與24 h差異均有統計學意義，P值分別為0.056、0.021、0.005、0.002、0.004、0.004。

圖3 各時間點平行病理組的腫瘤HE染色切片鏡下表現。隨著給藥時間的延長，腫瘤內壞死區逐漸增多，以中心為著，并出現進行性加重的出血及壞死，40倍鏡下4 h和24 h腫瘤內出現較多新生血管。CD31染色可見給藥后1 h，腫瘤血管明顯塌陷，管徑狹窄，2 h后大部分管腔閉塞，血管數量減少。4 h及24 h腫瘤內見新生不成熟小血管，總體上血管數量有所增加Fig.3 HE staining of the parallel pathology group at each time point shows that with the prolongation of time after injection, the tumor necrosis area gradually increased especially in the middle, as well as the progressive increase in bleeding and necrosis. New vessels can be observed at 4 h and 24 h under 40× microscope. CD31 staining shows that tumor vessels are collapse and stenosis at 1 h after injection. At 2 h most of the lumens occlude and the amount of the vessels reduce. At 4 h and 24 h newborn immature small vessels can be observed inside the tumor, while the number of vessels increase in total.

3 討論

3.1 A64的作用機制

A64是長春堿衍生物，屬于小分子微管蛋白結合劑類血管破壞劑，可以靶向作用于腫瘤不成熟的新生血管內皮細胞，引起腫瘤血管的塌陷、破壞，具有明顯的抗腫瘤療效。其作用機制是微管蛋白結合劑與血管內皮細胞微管蛋白的結合而抑制微管聚合，引起微管解聚，并重構肌動蛋白骨架引起內皮細胞形態發生改變，阻斷腫瘤微血管的血流，增加血管滲透性，腫瘤微循環血流減少，暴露的血管基底膜，激活凝血機制，導致凝血和出血，從而使腫瘤血管堵塞，達到破壞血管的作用[3]。正常成熟的血管內皮細胞的細胞排列規則，骨架發育完全，有血管壁周細胞和肌細胞的保護，基底膜完整，故對A64作用不敏感，因此，A64作為新型血管破壞劑，對腫瘤血管破壞具有特異性和更高的敏感性。

3.2 IVIM-DWI各相關參數的原理與臨床價值

DWI是目前唯一能夠檢測活體組織內水分子擴散運動的無創方法，其影像對比主要取決于組織間的表觀擴散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)，ADC值可量化評估組織平均擴散，反映病理生理改變引起的組織細胞水平的微觀變化，在臨床上已用于腫瘤良惡性病變的鑒別和療效預測等[4]。IVIM的理論是由Denis Le Bihan于1985年提出的，由于DWI影像上信號衰減的同時包括真性水分子擴散和毛細血管網中隨機血流微循環灌注，后者使擴散影像上出現假擴散信號，導致 ADC值反映的信息有限?；诖死碚?，在一組包含高b值(≥200 s/mm2)與低b值(≤200 s/mm2)的掃描序列下，應用雙指數模型對衰減信號進行分析，得出反映組織擴散特性及灌注特性的參數：真性擴散系數(D值)、假性擴散系數(D*值)、灌注分數(f值)。D值代表活體內水分子的擴散，反映擴散情況；D*與f值代表水分子在血管內的宏觀運動，反映灌注情況[5]。因此，IVIM可以分離出組織水分子的真實擴散信息和微循環細血管內血液的灌注信息，比DWI更能準確地反映腫瘤微觀的變化，同時可以在不注射對比劑的情況下無創、定量地反映組織內的灌注改變，可用于腹部臟器良惡性病變的鑒別、早期診斷疾病、定量觀察病情進展，成為研究的熱點[6-9]。Chiaradia等[10]用IVIM參數評價結直腸癌肝轉移患者轉移瘤壞死程度和存活組織的相關性；Lewin等[11]用IVIM的f值作為肝細胞肝癌抗血管生成治療的標志物進行了探索性研究。

3.3 A64給藥后D值變化及其病理學改變

IVIM中的D值代表體素內真性水分子擴散，稱為真性擴散系數，代表純的水分子擴散運動。本實驗的影像檢查組中，D值表現為在給藥后2 h內持續下降，此時病理對照組的HE染色顯示腫瘤壞死變化不明顯，細胞數量仍較多，排列密，CD31血管染色已顯示腫瘤血管出現形態失常，管腔狹窄。D值于4 h開始回升，24 h上升恢復至基態水平，對應的HE染色顯示腫瘤組織內壞死、出血范圍進一步擴大。因此推測前2 h腫瘤D值的下降是由于A64短時間內迅速引起血管壁破壞、狹窄導致腫瘤組織血流量下降，腫瘤細胞缺血缺氧、腫脹，細胞外容積減小，水分子運動受限；4 h及24 h時，腫瘤壞死增多，逐步抵消細胞腫脹所致的D值減低，因此觀察到D值逐漸上升，提示了A64治療后早期D值的變化與腫瘤細胞腫脹和壞死相關。

3.4 A64給藥后腫瘤D*值和f值的變化及其病理學改變

IVIM中的D*代表體素內微循環灌注，稱為假性擴散系數；f即灌注分數，代表體素內微循環灌注效應占總體擴散效應的容積率。本實驗中影像檢查組D*值和f值給藥后1 h、2 h、4 h內持續性下降，24 h時腫瘤D*值和f值明顯回升，其對應的CD31染色和CD31-IOD值的結果顯示，給藥后1 h、2 h血管壁即塌陷、閉塞，血管數量減少，平均光密度值下降，4 h及24 h觀察到腫瘤內新生不成熟小血管增多，平均光密度值上升。這是由于雖然血管破壞劑主要是能夠引起腫瘤的大面積壞死或死亡，但同時還與宿主的正常細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞、血小板、內皮細胞和基質成纖維細胞等關系密切，這些正常細胞能夠分泌促血管生成因子，在治療過程中能促進腫瘤血管再生，腫瘤的缺血缺氧也可促使微血管增生，血管的再生反過來又影響腫瘤的灌注，因此灌注的增高可解釋為新生血管所致。D*值和f值的動態變化總體趨勢與CD31-IOD值相似，只在4 h的時間點上存在不同，即灌注的改變要晚于不成熟微血管數量上的變化，這是由于異常新生的血管結構上不成熟，在灌注上不如給藥前的血管。這既從病理學上解釋了D*值和f值升高，同時也反映功能上的灌注增加要遲于新生微血管數量與形態學的變化。Joo等[12]也報道了利用IVIM對血管破壞劑CKD-516治療兔肝癌模型療效進行評估，結果顯示D*和f值在給藥后4 h明顯下降，24 h回升，與本實驗在這兩個時點上趨勢相似。

本實驗中的f值和D*值的變化雖然相似，但f值變化的幅度不如D*值，推測給藥后早期灌注下降的同時，總體擴散水平也在下降，給藥后期，灌注恢復的同時，壞死區增大，腫瘤擴散受限也有所減輕，故微循環灌注所占的百分比變化不夠顯著。Shi等[13]將f值和D*值與MRI對比劑增強參數進行了對照研究，在觀察鼠非小細胞肺癌對血管破壞劑反應的實驗研究中發現，IVIM參數中的D、f和D*3個值與DCE-MRI的Ktrans有較好的相關性，但不同臟器與腫瘤的研究結果并非完全一致[12,14]。因此f值和D*值能否反映肝細胞癌的血供或取代對比劑增強MRI尚需進一步研究。

綜上所述，IVIM-DWI相關參數可以定量檢測A64治療后裸鼠肝癌移植瘤的超早期的真實擴散信息和微循環灌注信息，從而間接地反映給藥后腫瘤缺血、壞死和瘤內新生血管的形成，為療效的檢測提供無創的評價方法。

[References]

[1] Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med, 1971, 285(21): 1182-1186.

[2] Le Bihan D, Breton E, Lallemand D, et al. MR imaging of intravoxel incoherent motions: application to diffusion and perfusion in neurologic disorders. Radiology, 1986, 161(2): 401-407.

[3] Han FG, Qi X, Li J. Current development status of the vascular disrupting agent CA4 (combretastatin A-4). Chin J Pharmacol Toxicol, 2013, 27(4): 739-744.韓福國, 戚欣, 李靜. 考布他汀A_4類腫瘤血管破壞劑的研究進展.中國藥理學與毒理學雜志, 2013, 27(4): 739-744.

[4] Zhou TT, Wang JL, Yang Y, et al. The application of conventional MRI, DWI and DCEI in focal liver lesions. Chin J Magn Reson Imaging, 2015, 6(1): 33-39.周婷婷, 王建良, 楊毅, 等. 常規MRI、DWI和動態增強掃描在肝臟局灶性病變診斷中的應用. 磁共振成像, 2015, 6(1): 33-39.

[5] Le Bihan D, Turner R. Intravoxel incoherent motion imaging using spin echoes. Magn Reson Med, 1991, 19(2): 221-227.

[6] Yang HJ, Liang ZH. Application and advances of IVIM-DWI in abdomen. Chin J Magn Reson Imaging, 2016, 7(7): 546-550.楊海靜, 梁宗輝. IVIM-DWI腹部應用及其進展. 磁共振成像,2016, 7(7): 546-550.

[7] Doblas S, Wagner M, Leitao HS, et al. Determination of malignancy and characterization of hepatic tumor type with diffusion-weighted magnetic resonance imaging: comparison of apparent diffusion coefficient and intravoxel incoherent motion-derived measurements.Invest Radiol, 2013, 48(10): 722-728.

[8] Ichikawa S, Motosugi U, Ichikawa T, et al. Intravoxel incoherent motion imaging of focal hepatic lesions. J Magn Reson Imaging,2013, 37(6): 1371-1376.

[9] Kang KM, Lee JM, Yoon JH, et al. Intravoxel incoherent motion diffusion-weighted MR imaging for characterization of focal pancreatic lesions. Radiology, 2014, 270(2): 444-453.

[10] Chiaradia M, Baranes L, Jeanne TVN, et al. Intravoxel incoherent motion (IVIM) MR imaging of colorectal liver metastases: are we only looking at tumor necrosis?. J Magn Reson Imaging, 2014,39(2): 317-325.

[11] Lewin M, Fartoux L, Vignaud A, et al. The diffusion-weighted imaging perfusion fraction f is a potential marker of sorafenib treatment in advanced hepatocellular carcinoma: a pilot study. Eur Radiol, 2011, 21(2): 281-290.

[12] Joo I, Lee J M, Grimm R, et al. Monitoring vascular disrupting therapy in a rabbit liver tumor model: relationship between tumor perfusion parameters at IVIM diffusion-weighted MR imaging and those at dynamic contrast-enhanced MR imaging. Radiology, 2016,278(1): 104-113.

[13] Shi C, Liu D, Xiao Z, et al. Monitoring tumor response to antivascular therapy using non-contrast intravoxel incoherent motion diffusion-weighted MRI. Cancer Res, 2017, 77(13): 3491-3501.

[14] Chandarana H, Lee VS, Hecht E, et al. Comparison of biexponential and monoexponential model of diffusion weighted imaging in evaluation of renal lesions preliminary experience. Invest Radiol,2011, 46(5): 285-291.