NP-DA-Dextra-FA靶向納米分子探針對人肝癌細胞的體外磁共振成像研究

唐納，趙光明，李征宇，張貴祥，王中領

磁共振分子成像是一種無創、具有高特異性的新型診斷方法，可從細胞、分子水平對腫瘤進行靶向顯像及診斷。葉酸受體(folate receptor，FR)在很多惡性腫瘤中超表達，其表達方式有很強的基因及組織特異性，但是在正常細胞及組織中無表達[1-2]。作為非病毒載體，超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)因其具有超順磁性及低毒性的特點，在分子影像磁共振成像中被廣泛應用。本研究制備葉酸(folate，FA)靶向的多功能納米復合物，研究其作用于人肝癌細胞Bel7402的細胞靶向性及應用磁共振成像系統對其監測的可能性。

1 材料與方法

1.1 試劑

NP-DA-Dextra-FA葉酸靶向及非靶向NP-DADextran納米分子探針(蘇州大學化工學院與材料部提供)，多巴胺(Acros公司)，葡聚糖(上海滬峰公司)，葉酸(TCI公司)，人肝癌細胞Bel7402 (購于上海生科院細胞庫)，胎牛血清(杭州四季青公司)，葉酸DMEM細胞培養液(美國Gibco公司)，0.25%胰酶(Sigma公司)。

1.2 主要設備

C O2培養箱(德國H e r a b u s公司)，F E I TecnaiG220透射電子顯微鏡，GE signa HDx 3.0 T磁共振成像系統， Jjouan MR23i低溫高速離心機，NikonYS100倒置相差顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4和Fe3O4-NPs的合成[1]

油酸鈉(9.125 g，30 mmol)、FeCl3?6H2O(2.7 g，10 mmol)倒入正己烷(35 mL)、去離子水(15 mL)、乙醇(20 mL)混合物中，經4 h反應(70 ℃)后分離紅褐色含油酸鐵的正己烷混合物，用去離子水3次洗滌后放入旋轉蒸發儀去除正己烷，獲得含油酸鐵的油狀混合物。取含油酸鐵的混合物(9 g，10 mmol)加入油酸(1.41 g，5 mmol)、十八碳烯(25 g)，在N2條件下，升溫到320℃隨后攪拌30 min。接著沉淀、離心，并用正己烷和乙醇洗滌3次，分散于正己烷中。取10 mL N,N-二甲基甲酰胺，將Fe3O4(100 mg) 分散其內，之后加入鹽酸多巴胺(200 mg) (N,N-二甲基甲酰胺20 mL)溶液，超聲20 min后攪拌12 h。然后經過葡聚糖的活化、連接葡聚糖及葉酸的活化一系列反應制作的產物備用。所得納米分子探針進行一系列表征測量。

1.3.2 細胞培養

將人肝癌細胞Bel7402接種于含10%胎牛血清的無葉酸DMEM培養基中隨后放在培養箱內以37°C、5% CO2的條件下培養，待貼壁的H460細胞密度生長至90%時，去除原培養液，加入胰蛋白酶進行消化，每3 d傳一代。在培養過程中用光學顯微鏡對培養中的細胞進行動態觀察。待細胞生長總數達1×107個時停止傳代備用。

1.3.3 普魯士藍染色

將人肝癌細胞Bel7402的靶向及非靶向分子探針行普魯士藍染色。將1×106個的Bel7402細胞分別與鐵濃度為40 μg/ml的葉酸靶向與非靶向分子探針在無葉酸DMEM培養液中孵育2 h后(置于37°C、5% CO2培養箱中)，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，用4%戊二酮固定20 min后，蒸餾水洗3次，核固紅復染3 min后，蒸餾水洗滌3次，隨后在顯微鏡下觀察細胞內鐵染色效果。

1.3.4 競爭性抑制實驗

將數量為1×106的人肝癌細胞Bel7402與不同濃度(0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L)的游離FA孵育1 h后，再與鐵濃度為40 μg/ml的FA納米靶向探針孵育1 h后，行MR體外成像。

1.3.5 體外磁共振成像

將人肝癌細胞Bel7402接種在6孔板內，分別與鐵濃度為0 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml的FA靶向與非靶向納米分子探針與1×106的人肝癌細胞孵育2 h，用PBS液沖洗3次，經過胰蛋白酶消化后重懸于0.5 ml 1%瓊脂糖的EP管中。(1)成像方法：應用3.0 T MR掃描儀進行懸浮細胞成像，采用動物小線圈。掃描參數：采用快速自旋轉回波(fast spin echo，FSE)序列：TR/TE=4240 ms/108 ms；層厚=2 mm；層間距=1 mm；矩陣=256×256；FOV=8 cm×8 cm；T2 mapping掃描，采用多回波SE序列，共采集8回波，TR 1500 ms，TE 9.4 ms、18.7 ms、28.1 ms、37.4 ms、46.8 ms、56.1 ms、65.5 ms、74.8 ms，層厚2 mm；層間距1 mm；矩陣=256×256；FOV=8 cm×8 cm。(2)成像分析：選擇測量面積大于30 mm2的感興趣區(region of interest，ROI)測量信號強度和R2值，保持測量在同一橫斷面，每組樣本含量保持一致，同一樣品重復6次測量，計算平均值及標準差。

1.4 統計學分析

數據統計采用SPSS 17.0軟件包，所有數據均用均數±標準差來表示。T2磁共振信號強度分析運用One-way ANOVA單因素方差分析，兩兩比較運用SNK及LSD檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NP-DA-Dextra-FA葉酸靶向納米復合物的制備和表征

SPIO和FA連接成功，分子靶向納米探針呈現出特異性的苯環峰值(圖1)，峰值約2650 cm-1；粒徑在透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)下測得約14 nm。經TEM觀察，分子納米探針分布均勻、形態規則。

2.2 普魯士藍染色實驗結果

NP-DA-Dextra-FA葉酸靶向納米分子探針(40 μg/mL)同人肝癌細胞Bel7402孵育后，肝癌細胞內可觀察到大量鐵顆粒沉積；FA非靶向NP-DA-Dextran納米分子探針(濃度40 μg/mL)與Bel7402細胞孵育后，內僅見少量鐵顆粒沉積(圖2)。

2.3 體外競爭抑制實驗

隨著細胞培養基中游離FA濃度從0 mmol/L增高到2.0 mmol/L時，Bel7402肝癌細胞的T2信號強度隨著游離FA濃度增高而逐漸變亮(圖3)。

2.4 MR 體外成像結果

鐵濃度為0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的葉酸靶向NP-DA-Dextra-FA復合物和非靶向NP-DA-Dextran納米分子探針分別與人肝癌Bel7402細胞孵育2 h后，靶向組細胞T2信號強度隨鐵濃度的升高顯著降低，非靶向組細胞T2信號強度下降相對不顯著(圖4A)。T2 maping序列顯示R2值隨著鐵濃度的升高顯著升高，非靶向組細胞的R2值升高相對不顯著(圖4B)，兩組R2值分別為圖4B (a)依次測量為1.38×10-2ms-1、1.64×10-2ms-1、1.76×10-2ms-1、2.22×10-2ms-1、2.50×10-2ms-1、4.96×10-2ms-1；圖4B (b)依次測量為1.42×10-2ms-1、17.11×10-2ms-1、27.51×10-2ms-1、7.33×10-2ms-1、12.34×10-2ms-1、20.08×10-2ms-1。

2.5 信號強度變化、信號強度變化率與濃度間的關系

FA靶向NP-DA-Dextra-FA納米分子探針和非靶向NP-DPA-Dextran納米分子探針分別與人肝癌細胞Bel7402孵育后，FA靶向NP-DA-Dextra-FA分子探針組腫瘤細胞MR信號強度隨著鐵濃度的升高明顯降低，而非靶向NP-DA-Dextran納米分子探針組降低相對不顯著。在濃度80 μg/mL時，兩組的信號強度下降率分別為89.67%及37.92%，靶向組的信號強度變化率約為非靶向組的2～3倍，兩組比較差異具有統計學意義(P＜0.01) (圖4C，表1)。

3 討論

葉酸作為一種B族天然維生素，在人體一碳單位代謝過程中有著極為重要的意義。葉酸受體在肝癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、子宮內膜癌及結腸癌等[1-6]絕大多數惡性腫瘤中高表達或超表達，具有很強的組織特異性，在正常組織細胞中不表達或呈低表達。超順磁性氧化鐵具有明顯的T2負超順磁效應，在肝、脾等器官磁共振成像中常作為一種理想的對比被廣泛應用。FA具有價格低廉、低免疫源性等優點，在臨床中較為常用，FR介導的靶向成像及給藥成為該領域研究的熱點[7-10]。以葉酸為載體，通過FR受體介導，可以將超順磁性氧化鐵帶至腫瘤細胞表面，進入細胞內后攝入細胞胞漿，從而縮短腫瘤T2弛豫時間，對藥物的釋放監測及提高腫瘤診斷敏感性具有重要價值，以實現MRI對腫瘤治療監測的可視化。

此研究運用對人肝癌細胞Bel7402與葉酸靶向及非靶向分子探針進行孵育，通過比較由于人肝癌細胞Bel7402對靶向分子納米探針攝取的差別而導致的磁共振信號強度差異，由細胞、體外分子水平來研究MR成像儀對腫瘤靶向成像和監測的可能性。FA具有靶向效應，主要表現在位點特異性、配體介導的納米分子探針在腫瘤細胞中的聚集。本研究自行設計的FA靶向納米分子探針，并利用非靶向納米探針作為對照組，在細胞水平去探討FA靶向納米分子探針對FR表達陽性的肝癌細胞的靶向效應。本研究中將不同濃度的FA靶向、非靶向分子探針與肝癌細胞孵育2 h后，通過MR T2成像、T2 mapping成像及普魯士藍染色觀察兩種分子探針與Bel7402細胞內攝的情況，初步實驗結果表明，靶向組的腫瘤細胞的攝取率比非靶向組明顯高，靶向組T2馳豫時間比非靶向組明顯減低，這表明由葉酸介導的納米分子靶向探針對人肝癌細胞Bel7402靶向效應明顯，普魯士藍染色實驗結果表明，人肝癌細胞Bel7402靶向組鐵顆粒含量明顯比非靶向組高。在體外競爭抑制實驗中，結果進一步表明了FA修飾的納米分子探針對肝癌細胞的靶向攝取主要依賴于FR。

NP-DA-Dextran-FA納米分子探針是一種靶向對比劑，亦具有一定的特異性，其靶向效應的機制可能為以下幾種。(1) FR受體與FA特異性結合，隨后將分子靶向納米探針帶至腫瘤細胞的表面，來減低腫瘤的T2信號強度。(2)細胞外的葉酸被瘤細胞表面的葉酸受體介導，經過內化途徑進入細胞內，從而導致瘤細胞T2信號減低，這是葉酸進入瘤細胞內的重要途徑[11]。(3)磷脂酶C裂解瘤細胞表面的葉酸受體后，使瘤細胞間隙內的葉酸受體明顯聚集，故使瘤細胞間隙內分子納米探針靶向聚集[12]。這幾種機制可對腫瘤內分子靶向探針長時間聚集及其特異性給予了恰當的解釋。

圖1 NP-DA-Dextra-FA納米分子探針紅外光譜圖，紅外峰值約為2650 cm-1Fig.1 The infrared spectrogram of NP-DA-Dextra-FA nanoparticles probe,the infrared peak is 2650 cm-1

圖2 普魯士藍染色圖。A：葉酸靶向NP-DA-Dextra-FA分子探針；B：非靶向NP-DA-Dextran分子探針普魯士藍染色圖Fig.2 Prussian blue staining. A: Folate-targeted NP-DA-Dextra-FA nanoparticles probe; B: Non targeting NP-DA-Dextran.

圖3 體外競爭抑制實驗圖Fig.3 Competitive inhibition experiment in vitro

圖4 FA非靶向納米與靶向納米分子探針MR信號強度的改變及T2馳豫時間的改變Fig.4 The change of signal strength of folate-targeted NP-DA-Dextra-FA and non targeting NP-DA-Dextran nanoparticles probe

表1 不同鐵濃度葉酸靶向對比劑及非靶向對比劑與Bel7402 MR孵育后信號強度變化Tab.1 The change of signal strength of different concentrations of iron folic acid targeted contrast agent and the targeted contrast agent incubation with Bel7402 cells

SPIO在MR成像、熱療中得到廣泛的應用，和非聚合的Gd聚合物對比劑相比較，SPIO呈現更高的靈敏度。通常其表面被用葡聚糖、PEI及樹枝狀大分子等衍生物修飾，使其具有更好的生物相容性及穩定性[13]。以提高對比劑的水溶性及分散性。而未經任何修飾的SPIO，其表面帶有負電荷，很難被同樣帶有負電荷的細胞膜所攝取。此研究的超順磁性氧化鐵與多巴胺、葡聚糖相連并通過修飾后，粒徑大小為14 nm，完全符合MR對比劑的基本條件。本研究課題組研制的FA分子靶向探針因其有低毒性及良好的生物相容性等優點，其應用前景極為廣泛。

葉酸受體介導的磁性納米分子探針可同時用作MR靶向對比劑，及運送藥物的載體，通過其介導的分子靶向納米探針連接抗腫瘤藥來靶向治療腫瘤并行磁共振成像監測已是此領域的研究熱點。目前國內外相關研究較多局限于腫瘤細胞分子靶向攝取機制，但是尚面臨瘤細胞對特定納米分子靶向探針的特異性識別及靶向藥物在瘤內有效釋放等問題，這將成為此領域的焦點問題，同時也面臨著巨大的挑戰[14]。

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