超臨界溶液浸漬法制備載藥多孔微球用于肺部吸入式給藥

唐 川

（大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622）

藥物療效的發揮，不僅依賴于藥物的成分及藥物的含量，同時也受到給藥系統的影響[1]。傳統的給藥途徑如口服給藥，胃酸會破壞大部分蛋白質或多肽類藥物的結構；而靜脈注射給藥則是一種侵入式給藥途徑，病人順應性低。肺部由于比表面積大、毛細血管豐富等特點，成為理想的給藥部位，肺部吸入式給藥也成為給藥途徑研究領域的熱點之一。已有的研究表明，蛋白質藥物經肺部給藥，藥效發揮迅速且藥代動力學可重復性好[2]。但肺部吸入式給藥也有一定的局限，比如要求顆粒的空氣動力學粒徑在一定范圍內（1～5 μm），否則不能進入肺部達到給藥效果。實心藥物顆粒的空氣動力學粒徑基本和幾何粒徑相同，1～5 μm的實心顆粒雖然可以到達肺部深處，但會被巨噬細胞吞噬（巨噬細胞可吞噬大約1～5 μm幾何粒徑的顆粒），因此只有顆粒的空氣動力學粒徑在 1～5 μm之間，而幾何粒徑不在1～5 μm之間才能滿足肺部吸入式給藥要求。多孔微球由于其密度較同材料實心微球小，因此其空氣動力學粒徑與實心微球不相同，采用多孔微球作為藥物載體可實現肺部給藥，并且避免被巨噬細胞吞噬。但如何在保證藥物活性的同時，將藥物負載到多孔微球中，制備粒徑滿足肺部吸入式給藥要求的微粒是亟待解決的問題。

超臨界溶液浸漬法(supercritical solution impregnation, SSI)是一種將小分子物質負載到聚合物中的過程技術，主要是利用超臨界流體高擴散系數、低黏度及其對聚合物的溶脹作用[3]。自1986年Sand[4]使用超臨界溶液浸漬(supercritical solution impregnation, SSI)制備得到含藥物成分的聚合物以來，SSI被認為在藥物制備領域具有廣闊的應用前景。SSI過程制備藥物具有如下幾種顯著優勢：（1）操作條件溫和；（2）產品有機溶劑殘留量低；（3）藥物在基質中均勻分布，可有效避免釋藥過程中的突釋現象，可達到緩控釋給藥的目的[5,6]；（4）基質制備過程與藥物負載過程分開進行，載體多樣，不受載藥過程制約[7]。

本文以生物相容性材料聚乳酸（PLLA）為材料制成多孔微球，以地塞米松為模型藥物，采用 SSI法將藥物負載至多孔微球中制備載藥多孔微球。考察載藥多孔微球的載藥量、形貌、空氣動力學粒徑以及釋放行為等，探索載藥聚乳酸多孔微球在肺部吸入式給藥中的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

左旋聚乳酸（PLLA），分子量 11 kDa；二氧化碳，純度99.9%；地塞米松，純度大于98%；泊洛沙姆F-127，純度大于98%；聚乙烯醇，AH-26；無水乙醇、二氯甲烷，分析純。

1.2 實驗儀器

紫外可見分光光度計，型號Ultraspec 3320 pro；動力學粒徑譜儀，型號 APS-3321；高速分散器，型號 XHF-D；恒溫水浴槽，型號 DF-101S；真空干燥箱，型號DZF-6050；循環水式真空泵，型號SHB。

1.3 PLLA多孔微球的制備

本研究使用泊洛沙姆作為多孔微球的致孔劑，采用乳液-溶劑揮發法制備PLLA多孔微球。實驗步驟如下：（1）將泊洛沙姆與PLLA溶于二氯甲烷中形成泊洛沙姆與PLLA質量比為3:7，總聚合物濃度為3%的溶液。（2）將配制好的聚合物溶液加入到濃度為1%的聚乙烯醇水溶液中，使用高速分散器在 3000 rpm下分散3 min，形成均一乳液。（3）乳液置于30℃恒溫水浴槽中，200 rpm條件下攪拌5 h以揮發除去二氯甲烷。（4）待PLLA 多孔微球固化后，8000 rpm離心5 min收集得到PLLA多孔微球，并用去離子水清洗三次，以除去多孔微球表面的聚乙烯醇，干燥得到PLLA多孔微球。

1.4 載藥PLLA多孔微球的制備

采用超臨界流體裝置，通過SSI將地塞米松負載于PLLA多孔微球，實驗裝置及流程如圖1所示[8]。具體流程如下：在高壓釜的頂部放置并固定盛放有PLLA多孔微球的濾紙，在高壓釜的底部放置盛有過量地塞米松的濾紙。地塞米松與PLLA多孔微球分開放置，避免兩者的直接接觸和混合。啟動設備，CO2經鋼瓶流出，冷卻成為液體，經高壓泵加壓后在40℃進行預熱后進入高壓釜，設定攪拌器轉速 60 rpm，高壓釜內壓力15 MPa、溫度40 ℃，并保持一段時間。實驗結束后關閉鋼瓶、高壓泵，打開泄壓閥卸去高壓，得到載藥PLLA多孔微球，保存供后續檢測。

圖1 超臨界溶液浸漬法實驗流程圖

1.5 PLLA 多孔微球載藥量測定

采用紫外分光光度計對載藥多孔微球載藥量進行測定。實驗步驟如下：稱取25 mg PLLA載藥多孔微球樣品，加入2.5 mL二氯甲烷將樣品完全溶解；揮發除去二氯甲烷，再加入2.5 mL無水乙醇萃取出樣品中的藥物；8000 rpm離心5 min，上清液在240 nm處測定吸光值，根據地塞米松標準曲線計算得到地塞米松質量，根據式1計算得到樣品的載藥量（DLC)，即藥物質量與聚合物質量之比。

1.6 載藥 PLLA 多孔微球的表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察載藥多孔微球形貌。取少量樣品使用導電膠將其固定置于銅臺上，將多余的未被固定的樣品除去，真空下噴金1 min，然后在SEM下對樣品的形貌進行觀察并拍攝圖片。利用Image-pro plus軟件對樣品的掃描電子顯微鏡圖片進行分析，獲得微球的平均粒徑。

使用空氣動力學粒徑譜儀測定 PLLA多孔微球的空氣動力學粒徑。空氣動力學粒徑譜儀可測定空氣動力學直徑為0.5～20 μm之間的顆粒。實驗設定進氣量5 L/min，分別測定空白多孔微球和浸漬后多孔微球空氣動力學粒徑，并定義可吸入比為空氣動力學直徑在1～5 μm之間的顆粒。

1.7 載藥多孔微球的體外釋放行為

載藥多孔微球的釋放行為通過體外釋放實驗進行考察。37℃條件下，稱取約25 mg載藥多孔微球樣品置于離心管中，加入4 mL 磷酸緩沖液（0.05 M，pH7.4），在一定的時間間隔進行取樣。取樣時，5000 rpm離心 5 min，取上清液2 mL，同時補加磷酸緩沖液2 mL，分散后繼續進行釋放實驗，樣品在240 nm處測量吸光度。按照標準曲線可得地塞米松質量，計算得到載藥PLLA多孔微球在體外的釋放曲線。

2 結果與討論

肺部吸入式給藥系統不僅要求藥物微粒空氣動力學粒徑處于1～5 μm之間，而幾何粒徑不處于1～5 μm之間，同時還要求多孔微粒具有一定載藥量，并能夠以一定速率釋放藥物，因此本文對載藥多孔微球的載藥量、形貌、空氣動力學粒徑、釋放行為進行了研究。

2.1 浸漬時間對載藥量的影響

SSI過程中浸漬時間對多孔微球載藥量影響如圖2所示。由圖中可以看出，隨著浸漬時間的增加，載藥量逐漸增加，并在1 h后趨于平衡，1 h后多孔微球載藥量變化不大。SSI過程主要包括三個階段：藥物在超臨界CO2中的溶解；藥物在聚合物中的擴散；藥物在超臨界CO2中和聚合物中的分配。這三個階段中，超臨界CO2環境下藥物在聚合物基質中的擴散最慢，因此是SSI過程的限速步驟。在實驗設定條件下（40℃，15 MPa）達到平衡載藥量的時間為1 h，為保證CO2，聚合物和藥物能達到分配平衡，在后續實驗中浸漬時間均定為2 h。

圖2 SSI過程中浸漬時間對載藥多孔微球載藥量的影響

2.2 載藥多孔微球的載藥量

通過乳液-溶劑揮發法制備的PLLA多孔微球，在用SSI法進行藥物負載后（40℃，15 MPa，浸漬時間2 h），得到載藥PLLA多孔微球，通過載藥量測定，得出載藥量為1.0 mg/g。這說明藥物可以通過SSI方法負載到聚合物中，這為藥物+載體形式的藥物制劑提供了一種綠色化的制備方法。

2.3 載藥 PLLA 多孔微球的表征

2.3.1 掃描電子顯微鏡（SEM）結果分析

PLLA多孔微球的SEM圖片在SSI過程負載藥物前后如圖3所示，其中圖 3（a）表示采用泊洛沙姆作為致孔劑，使用乳液-溶劑揮發法制備的空白PLLA多孔微球，可以看到大部分PLLA微粒呈球形，表面存在孔洞；圖3（b）為利用SSI過程在40℃，15 MPa條件下浸漬2 h負載藥物后的載藥PLLA多孔微球，可以看出經過SSI過程處理之后，微球粒徑變小，表面孔洞部分消失。這是因為在CO2環境中，PLLA玻璃化轉變溫度（Tg）大幅下降，聚合物表面出現部分軟化現象，使得多孔微球表面的孔洞融合，微球由于塌縮粒徑變小。這種表面孔洞消失的現象對于多孔微球在緩控釋給藥方面的應用是非常有利的，表面孔洞的小時可以有效避免多孔微球在藥物釋放過程中產生的突釋現象。

圖3 PLLA多孔微球的SEM圖片

2.3.2 多孔微球粒徑分析

藥物顆粒的空氣動力學性質極大的影響藥物在肺部的吸入給藥過程。只有空氣動力學粒徑在 1～5 μm之間的顆粒可以進入肺部深處，而大于5 μm的顆粒則容易進入口腔，小于1 μm的顆粒由于布朗運動停留在上呼吸道。除此以外，如果顆粒的幾何粒徑在1～5 μm之間則會被肺部巨噬細胞會吞噬，將其排出體外，不能達到治療效果，因此只有空氣動力學粒徑處于1～5 μm之間而幾何直徑大于5 μm的顆粒可以進入肺部深處，完成給藥[9]。

本研究采用空氣動力學粒徑譜儀測定多孔微球的空氣動力學粒徑并計算可吸入比，結果見表1。由結果可知，空白PLLA多孔微球經SSI過程負載藥物后，幾何粒徑變小和空氣動力學粒徑均變小，可吸入比由24.51%提高到66.44%，這表明經SSI過程將藥物負載與空白多孔微球后，有 66.44%的微粒可進入肺部深處達到給藥目的。

表1 SSI浸漬前后平均粒徑、空氣動力學粒徑及可吸入比

2.4 載藥多孔微球的體外釋放行為

進行體外釋放實驗時，選用SSI方法制備的載藥PLLA 多孔微球，其制備條件為40℃，15.0 MPa，載藥量為1.0 mg/g。在37℃下，載藥多孔微球的釋放曲線如圖4所示，在釋放的起始階段，載藥PLLA多孔微球在起始的24 h中共釋放了20.0%的藥物，在40天內累積釋放了61.6%的藥物。經過SSI過程處理后的PLLA多孔微球，表面孔結構閉合，微球表面為完整的球形，由于其表面封閉的結構阻止了地塞米松從微球到溶液主體的快速釋放，進而使多孔微球的突釋現象得到了規避。這種表面封閉的載藥PLLA多孔微球對于緩釋給藥來說是十分有利的。

圖4 在37℃下，載藥PLLA多孔微球體外釋放

3 結論

本文采用SSI法將地塞米松負載到PLLA多孔微球中，實驗結果表明，SSI法可將地塞米松成功負載于PLLA載藥多孔微球中；SEM圖片顯示PLLA多孔微球表面孔結構閉合，粒徑減小；載藥多孔微球的粒徑可滿足肺部吸入式給藥的要求。此外，PLLA載藥多孔微球的體外釋放實驗顯示，通過SSI過程制備的PLLA載藥多孔微球可降低藥物的突釋行為，延長釋放時間。因此，利用SSI法制備載藥多孔微球用于肺部吸入式給藥具有良好的應用前景。

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