水蔓菁滴丸中總黃酮和木犀草素的含量測定

刁海鵬， 杜 艷， 丁 紅， 孫體健

(山西醫科大學，山西太原030001)

水蔓菁為玄參科細葉婆婆納屬水蔓菁(Veronica linariifolia)，具有清熱解毒、利尿、止咳化痰等作用［1］。主要化學成分為芹黃素、木犀草素苷等黃酮類化合物［2］，現已有用水蔓菁制成的片劑，臨床用于治療慢性氣管炎、肺化膿癥、咳吐膿血、急性腎炎、尿路感染等疾病［3］。但是片劑存在服用量大，生物利用度低等問題。為滿足臨床用藥的需要，本課題組提取出水蔓菁的有效部位，制備成滴丸(制備方法另文撰述)。本實驗對水蔓菁滴丸中總黃酮和木犀草素含量測定方法進行了研究，以希望用總黃酮含量和木犀草素含量對水蔓菁滴丸質量進行控制并為該藥制定質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

儀器:LC-20A高效液相色譜儀 (日本島津);質譜儀:Quattro Premier Waters—2659(美國Waters公司);紫外分光光度計(上海菁華儀器);760CRT雙光束紫外-可見分光光度計(上海精密分析儀器廠);FA1004電子天平(上海分析天平儀器廠);真空干燥箱(DEG-402型天津天宇技術實業有限公司)。

試藥:乙腈為色譜純試劑;磷酸、氯仿、甲醇、甲酸、三氯化鋁、醋酸鉀均為分析純;蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所批號:1521-200401);木犀草素對照品(中國藥品生物制品檢定所批號:1477-200418);水蔓菁藥材，經山西省藥檢所鑒定為細葉婆婆納屬水蔓菁，產自山西省萬榮縣。

2 方法與結果

2.1 可見分光光度法測定水蔓菁滴丸中總黃酮含量［4，5］

2.1.1 供試品溶液的配制

對照品溶液的制備:精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品3.1 mg，置50 mL量瓶中，加適量60%乙醇，超聲使之溶解，再用60%乙醇稀釋至刻度，得對照品溶液(0.062 mg/mL)。

樣品溶液的制備:取水蔓菁滴丸15粒，研細，過80目篩，精密稱取滴丸粉末0.05 g，置25 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲使之溶解，加60%乙醇至刻度并搖勻。精密量取1 m L，置10 mL量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.1.2 測定波長的選擇

精密吸取樣品溶液及對照品溶液各1.0 mL，分別置10 mL量瓶中，0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL，0.1 mol/L KAc溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，放置30 min。在200 nm～500 nm范圍內掃描得測定波長為410 nm。

2.1.3 標準曲線的制定

分別精密吸取蘆丁對照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，各加0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL，0.1 mol/L KAc溶液3 mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置30 min，在410 nm處測定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標，以濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.034 9X－0.000 5，r=0.999 9，表明蘆丁濃度在 3.1 ～24.8 μg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.1.4 顯色穩定性考察

量取蘆丁對照品液2 mL，按2.1.3項下方法，顯色10 min后，每隔5 min測其吸光度值。結果表明，前20 min吸收度增大速度快，30～40 min吸光度穩定。故確定顯色時間為30 min。

2.1.5 精密度考察

取蘆丁對照品溶液，按2.1.3項下方法，重復進行5次試驗，結果表明，RSD為0.32%，儀器精密度良好。

2.1.6 重復性考察

精密稱取同一批水蔓菁滴丸，按樣品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液，按2.1.3項下方法進行試驗，結果表明，RSD為1.1%，本方法重復性良好。

2.1.7 回收率試驗

取已知總黃酮含量的水蔓菁滴丸，分別加入高、中、低劑量的蘆丁對照品，按樣品溶液的方法制備供試液，測定總黃酮含量，計算回收率，結果見表1。

表1 水蔓菁滴丸加樣回收率試驗結果(n=3)

結果表明:水蔓菁滴丸回收率符合方法學要求，方法準確可行。

2.1.8 水蔓菁滴丸總黃酮含量測定

分別取3批滴丸各15粒，研細，稱取滴丸粉末約0.05 g各3份，精密稱定，按2.1.1項下方法制備樣品溶液，同2.1.3項下操作，得水蔓菁滴丸中總黃酮平均含量為:6.17% ±0.3%。

2.2 樣品水解成分結構鑒定

經試驗發現制備的水蔓菁滴丸中目前沒有可用于高效液相法進行含量測定的特征性成分。但其含有木犀草素苷，經試驗發現其水解產物中含有木犀草素。

根據對水解時間，所加水解溶劑的體積、濃度等方面的考察［6］，最終確定水解條件為，精密稱取0.5 g水蔓菁滴丸粉末，置50 mL錐形瓶中，精密加入15 mL的2.5 mol/L的鹽酸甲醇液，水解1 h，放冷后補足重量，過濾，取濾液0.2 mL，置50 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。對水解液分別進行質譜法、薄層色譜法及高效液相法進行結構鑒定。

2.2.1 質譜法進行樣品水解成分結構鑒定［7，8］

從圖1～4可知木犀草素對照品與水解樣品中結構一致。木犀草素對照品碎片中含有285.13的峰，變換電壓后，有285.13、133.08兩個峰;而水解樣品中，相應的有285.07的峰，變換電壓后有285.29和132.98兩個峰，與木犀草素對照品相對應，初步確定水解樣品中含有木犀草素成分。

圖1 木犀草素對照品質譜圖1

圖2 木犀草素對照品質譜圖2

圖3 水蔓菁滴丸水解樣品質譜圖1

圖4 水蔓菁滴丸水解樣品質譜圖2

2.2.2 硅膠薄層鑒別

取木犀草素對照品加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液作為對照品溶液1。取水蔓菁滴丸的甲醇溶液，作為供試液2。取水蔓菁滴丸水解液兩份，濃縮，用甲醇溶解作為供試液3，4。吸取上述溶液各5μL，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以CHCl3-甲醇-甲酸(20∶4∶0.8)為展開劑，置預飽和15 min的展開缸內，展開，取出，晾干，噴三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視發現［9］，供試液3和4斑點中，在與對照品相同比移值位置上顯相同顏色的熒光斑點，而供試品2在與對照品色譜相應位置上，無熒光斑點，說明水蔓菁水解液中存在木犀草素。

2.2.3 高效液相法對水解產物進行定性鑒別

用反相高效液相法對水解產物進行定性鑒別后，發現對照品與水解產物在9.8min均有保留峰出現(見圖5、圖6)。說明水解樣品中含有木犀草素。

圖5 木犀草素對照品HPLC色譜圖

圖6 水蔓菁滴丸HPLC圖

2.3 HPLC法測定水蔓菁滴丸中木犀草素含量［10］

2.3.1 色譜條件

色譜柱:C18(5μm，4.6 mm×250 mm)(迪馬公司);測定波長:350 nm;流動相:乙腈-0.4%磷酸(30∶70);流速:1.0 mL/min;柱溫:23℃。

2.3.2 對照品和供試品溶液的制備

對照品溶液的制備:精密稱取木犀草素對照品約1.6 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻。制成木犀草素濃度為32μg/mL的對照品溶液。

供試品溶液:精密稱取0.5 g水蔓菁滴丸粉末，置于50 mL錐形瓶中，精密加入15 mL的2.5 mol/L的鹽酸甲醇液，水解1 h，放冷后補足重量，過濾，取濾液0.2 mL，置50 mL量瓶，用甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.3 標準曲線的制定

分別精密量取木犀草素對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，吸取上述溶液各20μL進樣，以峰面積(Y)對進樣量(X)進行回歸計算，得標準曲線方程:Y=2 863 820.99X－7 169.2，r=0.999 4，試驗結果表明:木犀草素在3.2～64μg/mL范圍內呈良好線性關系。

2.3.4 穩定性試驗

取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h 進樣20 μL，測得樣品中木犀草素峰面積值，結果表明:供試品溶液3～8 h內穩定性良好。

2.3.5 精密度試驗

精密量取同一份木犀草素對照品溶液20μL，重復進樣6次，木犀草素峰面積的RSD為0.6%。

2.3.6 重復性試驗

精密稱取同一批水蔓菁滴丸6份，按2.3.2項下供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試液，分別進樣20μL，RSD值為0.6%。

2.3.7 回收率試驗

取已知木犀草素含量的滴丸約1.5 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，按2.3.2項下供試品溶液制備方法，制備供試液后，分別加入木犀草素對照品溶液。分別進樣20μL，計算回收率，結果見表2。

2.3.8 樣品含量測定

精密稱取水蔓菁滴丸粉末0.5g3份，按2.3.2項操作，制備供試品溶液，進行含量測定，結果水蔓菁滴丸中木犀草素的含量為0.22%±0.02%。

表2 水蔓菁滴丸加樣回收率試驗結果(n=3)

3 討論

本實驗利用可見分光光度法和HPLC法建立了水蔓菁滴丸總黃酮和木犀草素含量的測定方法，該測定方法合理、準確、方便可行，可以為該藥制定質量標準提供參考，并為該藥的進一步應用奠定基礎。

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