納豆激酶的研究進展與展望

高澤鑫，何臘平，2*，劉亞兵，高冰，李翠芹，劉涵玉

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068；4.貴州大學化學與化工學院貴州，貴陽550025）

納豆激酶的研究進展與展望

高澤鑫1，何臘平1，2*，劉亞兵1，高冰3，李翠芹4，劉涵玉1

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068；4.貴州大學化學與化工學院貴州，貴陽550025）

納豆激酶主要是由枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）代謝產生的堿性絲氨酸蛋白酶，因其具有較強的溶栓能力而著稱。與其他的大多溶栓劑相比，納豆激酶具有安全性好、成本低、易吸收、副作用小等優點，因此可用于開發溶栓藥物。該文對國內外納豆激酶的溶栓功效、理化特性、發酵工藝、活性測定、純化、改性和產品進行了綜述，對其當前研究中的關鍵問題進行分析，并對未來納豆激酶的研究方向進行了展望。

納豆激酶；溶栓；理化特性；純化；改性

納豆起源于中國的秦漢時期，是傳統的發酵食品，在唐朝時期由高僧鑒真東渡時傳入日本，根據日本的風土漸漸演變為納豆，它被認為是日本人長壽的“秘方”，食用歷史1 000年以上[1]。納豆類似中國的發酵豆和豆豉，經枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）發酵而來，日本將納豆作為調味品和營養食品[2]，而國人主要將豆豉作為調味料食用。日本學者SUM IH等[3]于1987年首次對納豆及其提取物作了系統研究，最初將酶的提取物添加到纖維蛋白平板上，發現有明顯的溶栓作用，并確定其屬于具有纖溶活性的激酶。

血栓疾病嚴重影響著人類的健康，全球每年因患血栓類疾病死亡的人數多達1 200萬，中國約有260萬[4]，因此溶栓藥物的開發成為了研究的熱點。目前臨床上常見的溶栓藥物是鏈激酶（streptokinase，SK）、尿激酶（urokinase，UK）和組織型纖溶酶原激活劑（tissue-typeplasminogenactivator，t-PA），由于以上藥物存在給藥痛苦、副作用大、售價較貴、半衰期短的缺點，開發替代藥物成為了新的研究方向。具有高效溶栓作用的納豆激酶（nattokinase，NK）受到了廣泛的關注[5]，它可以降低纖維蛋白原、促進催化血纖維蛋白溶酶原轉化為血纖維蛋白溶酶、增加體內血栓溶解因子的合成的作用[6]。同時由于納豆激酶具有可口服、安全性高、價格低和纖溶活力強等優勢，其開發研究成為近年來溶栓類產品的研究熱點[7]，目前國內外研究在納豆激酶的理化特性及基因工程方面都取得了較大的進展。本文綜述了國內外關于納豆激酶的溶栓功效、理化特性、發酵工藝、活性測定、純化、改性和產品的相關研究，對當前研究中的一些問題進行分析，并對未來納豆激酶的研究方向進行了展望。

1 納豆激酶的研究進展

1.1 溶栓功效

通過大鼠實驗發現[9]，靜脈注射納豆激酶的溶血栓活性是血纖維蛋白原溶酶的4倍[8]。經健康人群口服和動物體內實驗可知，服用納豆激酶后，血液中的優球蛋白溶解加快，纖維蛋白降解產物增加。體內溶栓的實驗顯示，納豆激酶能夠有效減緩血栓的形成，顯著減少股動脈的長度及濕質量并有效提高血栓的再通率，顯著減少肺內血栓的形成。因此，納豆激酶擁有較強的體內溶栓作用，且溶栓作用明顯高于同等劑量的尿激酶[10]。

據體外實驗結果可知，納豆激酶能間接的將血纖維蛋白溶酶原轉化為血纖維蛋白溶酶，促使纖維蛋白凝塊水解，但納豆激酶沒有血纖維蛋白溶酶原激活劑的功能，不能直接將血纖維蛋白溶酶原轉化為血纖維蛋白溶酶，這一點不同于組織型纖溶酶原激活劑、尿激酶、鏈激酶[11]。納豆激酶能使纖溶酶原激活物抑制劑（plasm inogenadivatorinhibitor，PAI）失活，而PAI具有抑制組織纖維蛋白溶酶原激活劑的作用，可見納豆激酶是通過蛋白水解作用直接溶解纖維蛋白凝塊的[12]。

1.2 理化特性

納豆激酶是枯草芽孢桿菌代謝時產生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，為單鏈多肽結構，無二硫鍵，溶于水，固態呈淡黃色或白色。納豆激酶的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）序列由275個氨基酸殘基構成，其相對分子質量一般為28 000 u。該酶N末端為丙氨酸，等電點pH為（8.6±0.3）[13]。在室溫下，該酶在pH值6.0～12.0的范圍內具有很強的纖維蛋白水解能力，最適pH值為8，在酸性條件下會迅速失活。納豆激酶酶活不易受反復凍融影響，溫度達50℃以上時酶活性會逐漸喪失，超過60℃酶迅速失活，其最適溫度為45℃。此外金屬離子也會影響其活性，Hg2+能使它完全失活，Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+和Mg2+等對其酶活也有抑制作用，而Ca2+和Mg2+對酶活有明顯的激活作用[14]。

1.3 活性測定研究

納豆激酶是一種具有溶栓活性的蛋白酶，其活性測定原理依據于纖維蛋白原溶解系統的生理過程。主要檢測方法有：瓊脂糖-纖維蛋白原平板法、纖維蛋白原塊溶解時間法、四肽底物法[15]、酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbentassay，ELISA）和血清平板法等檢測方法，其中使用較為普遍的為瓊脂糖-纖維蛋白原平板法及纖維蛋白原塊溶解時間法[16]。

瓊脂糖-纖維蛋白原平板法操作方便、觀察簡便、成本低、可同時測多個樣品，應用較為普遍，但其測定值易隨培養時間、平板厚度的變化而變化，精確度較差；纖維蛋白原塊溶解時間法適用于粗酶活力的測定，對測定靈敏度要求較高的樣品誤差較大，同時不便于多個樣品的同時測定；四肽底物法雖操作簡單，但不能完全的反應酶活[17]；血清平板法雖能方便快速的同時用于多個樣品測定，但吸光度值會受人工血栓制備的影響誤差較大；ELISA準確性和特異性較高，但操作繁瑣、成本較高[18]。

2 納豆激酶的發酵工藝

納豆激酶是微生物代謝產物，只要工程菌活性穩定，工藝成熟即可實現大規模生產。由于NK發酵原料來源廣、生產周期短、產量高、價格低廉和易于提取純化等優勢，使其開發前景廣闊[19]。與液體發酵相比，固態發酵成本低、酶活力高、酶系豐富、設備操作簡單、易于企業擴大化生產且產率高[20]，因此，國內外食品發酵工業化生產普遍采用這種工藝[21]。發酵后的產品不僅可用作食品直接食用，還可以通過進一步的分離純化，制得不同級別的納豆激酶產品—納豆膠囊和納豆激酶膠囊。目前商業化發酵中采用的納豆激酶，活性為800～4 000 IU/g。納豆激酶發酵基質以含水量在50%～70%之間的黃豆為主[22]。此外可通過添加麥芽糖及少量的無機鹽，促進納豆激酶的合成，提高納豆激酶的含量，或以農副產品為原料降低發酵的成本[23]。

納豆激酶擁有現在市場上的一些溶栓藥物所無法比擬的優勢，因此專家學者期望利用它開發為新一代的溶栓劑。國內外有關篩選產納豆激酶菌株酶活力的報道多數為100～3 000 IU/g，少部分較高納豆激酶酶活力的報道為3 000～5 000 IU/m L[24-27]。就目前納豆激酶酶活力不足的研究現狀，提高納豆激酶酶活力對開發新型溶栓藥物非常關鍵。提升納豆激酶產量常用的方法有：對野生菌種進行大量篩選或誘變，以期得到產酶量高的菌種；優化發酵條件，包括對發酵原料和發酵因素的優化；利用基因工程技術，改造菌種的基因，得到產酶量高的菌種。

3 納豆激酶的純化

目前純化納豆激酶常用的方法有：鹽析、超濾、層析過濾以及凝膠過濾。其中王剛等[28]將發酵液通過硫酸銨沉淀和Sephadex G-50凝膠過濾層析進行分離純化，得到酶比活力、純化倍數、酶活回收率分別為22 388.81U/mg、19倍和42.1%的高純度納豆激酶。李睿等[29]采用硫酸銨沉淀和Phenyl Sepharose疏水柱層析分離純化納豆激酶NKⅡ粗酶液，得到酶活回收率、純化倍數、比活力分別為56.51%、17.90倍和48 407.77 IU/mg的高純度納豆激酶。CHOID B等[30]通過采用硫酸銨沉淀、超濾濃縮和陰離子交換層析的方法對冬蟲夏草中的粗酶進行分離純化，得到純化倍數高達86.1倍，回收率為13.7%的納豆激酶。這些研究大都存在著方法繁瑣、回收率較低、不利于保持酶活力和規模化生產等問題。隨著現代分離技術的發展，分離技術在發酵產品分離純化中應用日漸廣泛，把新型分離技術應用于納豆激酶的分離純化，對科學研究及生產意義重大。如LIU JG等[31]首次報道了使用AOT/異辛烷反膠束從發酵液中提取納豆激酶，并得到了純化倍數2.7倍、酶活回收率80%的酶液。3相分配法（threephasepartitioning，TPP）是一種高效的生物分離技術，GARGR等[32]采用該種方法，利用硫酸銨和叔丁醇的組合從粗提取物中沉淀蛋白質，得到了純化倍數5.6倍，酶活回收率為129.5%的酶液。

4 納豆激酶的穩定性與改性

由于納豆激酶屬于大分子化合物，所以在保藏過程中容易失活，因而需要找到更好地維持其酶活穩定性的方法。眾所周知苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）和異丙氟磷（diisopropyl fluorophosphate，DIFP）對絲氨酸蛋白酶具有強烈的抑制作用[5]。JAOUADIB等[33]研究發現常見的抑制劑如苯丙胺酰氯甲酮（technological pedagogicalcontentknow ledge，TPCK）、對甲苯磺酰賴氨酸氯甲基酮（toluene sulfonyl lysine ketone，TLCK）、胰凝乳蛋白酶烷化劑、苯甲脒和抑肽酶等均未對絲氨酸蛋白酶有明顯的抑制效果。碘乙酰胺、亮抑酶肽、二硫代蘇糖醇和胃酶抑素A等試劑同樣對酶活性幾乎沒有影響。

由于多數納豆激酶藥物以口服方式，因此要維持其在消化系統中的穩定性，主要需從物理包埋和分子改性上實現。DONG X Y等[34]利用植物甾醇、卵磷脂和甘露醇等為輔料通過正交試驗找到最佳的配比，實現封裝效率達65.25%并完成了對納豆激酶的有效包埋。在納豆激酶中加入蛋白胨、甘油、海藻酸鈉和明膠等同樣可幫助維持酶活力，并提高其熱穩定性或加入煮沸過的小麥提取液、肉湯以及血清蛋白等，可使納豆激酶在酸性條件下仍能保持一定的酶活[35]。這表明通過化學方法改性也能使NK在胃環境下保持一定的活力，因此可以通過口服達到應有的溶栓效果。常見的納豆激酶改性一般是建立在對功能基因探究和酶分子結構的基礎上。WENGM Z等[36]通過定點誘變構建的單突變體L31I是野生型NK的2倍催化效率，而雙突變體T220S/I31L和M 222A/I31L的酶活性有顯著增加，其中突變體M 222A/I31L相對于野生型NK的氧化穩定性有顯著增強。

5 納豆激酶類產品

5.1 納豆激酶藥品

現在溶栓藥物大多為纖溶酶原激活劑（plasminogen activator，PA）或其類似物，可直接或間接激活纖溶酶原（plasminogen，Pg）變成纖溶酶（plasm in，Pm），從而促進機體血栓的溶解。由溶血栓藥物的發展歷程，可將其分為四代[37]：第一代以UK和SK為代表，溶血栓效果好，但會出現系統性出血及過敏反應[38]；第二代藥物以tPA、葡激酶（straphylokinase，SaK）和NK為代表，與血栓基質有特異親和力，但是半衰期長，單療程用量較大；第三代藥物以瑞替普酶（reteplase，rPA）、蘭替普酶（lanoteplase，NPA）、靶向溶栓劑等為代表，對溶栓效率、特異性等進行了進一步的提升；第四代藥物主要是纖溶酶原激活劑抑制劑-1（plasm inogen activator inhibitor-1，PAI-1），通過增加血漿中tPA的濃度，促進溶栓活性，且可口服、價格較低。目前由于多種原因的限制，國內臨床用藥仍以UK和SK為主，根據當前情況，在第三、四代藥物產品還在緩慢進行的時候，更應該務實的對第二代藥物，尤其是納豆激酶產品的深入開發。因納豆激酶穩定性易受胃酸影響，令酶活力降低，所以應研發抗酸性更強的腸溶型制劑藥物。

5.2 納豆激酶保健品

目前，納豆激酶類保健品主要可分為膠囊劑和片劑兩種，還有個別的顆粒劑。已有10余家大公司生產納豆激酶類保健品，其中日本生物科研所最早將納豆激酶投入商業化生產，美國、韓國、臺灣地區相繼也有大量的納豆激酶生產廠家。在國家食品藥品監督進口保健食品數據庫中，并未查到任何國外納豆激酶類保健食品的批準文號。因此，國外的納豆激酶類保健食品數年內還不能進入中國市場，對國內產品暫時不會構成威脅。這也顯示出了國內對NK沒有形成完善、統一、嚴格的納豆激酶類保健食品成分標準，缺乏明確的功能指標和感覺評價體系。其次，國內納豆激酶保健品多以黃豆為主要原料，功能過于單一、發酵活性較低，不利于高活性產品的制備。

5.3 功能性食品

納豆作為一種與納豆激酶相關的功能性食品，與現有的臨床溶栓藥物相比具有許多優點，如安全性好、成本低、療效久和有效預防血栓產生[39]。納豆含有大豆的各種營養成分，且營養物質的含量均高于蒸煮的大豆。在其制作中，微生物酶系將大豆蛋白質分解為氨基酸和多肽，蛋白質的消化率由65%提高至80%，更有利于吸收[40]。此外，納豆還具有抗菌、抗腫瘤、防治骨質疏松、溶解血栓等功能[41]。據統計約90%的日本人將新鮮納豆作為日常必需食品，還將其列入中小學生營養配餐。在我國，鮮納豆由于其令人不愉快的臭味不易被消費者接受，這大大阻礙了通過飲食攝入納豆激酶，降低血栓發病率的措施。因此需開發適合國內消費者口味的納豆產品，目前通過從傳統發酵食品中分離出產納豆激酶生產菌株，或者將納豆食品膠囊化來掩蓋納豆的臭味，來解納豆口感不適問題[42]。在原有納豆食品的研究基礎上，許多科研人員也將納豆激酶運用到其他的食品中，如UPADHYAY V K等[43]將納豆激酶作為外源性水解蛋白酶去促進奶酪中的原發性蛋白水解，此過程不僅增加了大部分游離氨基酸的含量，而且這些氨基酸能用作許多分解代謝反應的底物，反過來又改善了奶酪的風味。

6 展望

本文概括了國內外關于納豆激酶的綜合研究，發現納豆激酶的溶栓抗栓效果和理化特性都有了系統性的研究，并開發了多種納豆激酶類產品。近年來通過對納豆激酶菌種的篩選和發酵工藝的改進，提高了納豆激酶的產量。在工業化生產中，優化了納豆激酶、口服納豆凍干粉、納豆激酶膠囊的分離純化工藝，豐富和改良了納豆產品的保健功效；改善了納豆原有的氨臭味，使其適用中國人的口感。在菌株選育方面，利用現代基因工程技術和誘變育種技術，選育可供大規模生產的優良菌株，提高了產量。納豆激酶的許多良好的生理調節功能及開發特性，使其受到越來越多的關注，為預防血管栓塞性疾病，解決大多溶栓藥物口服性差、價格昂貴、并發癥多等問題帶來的福音，前景十分廣闊。

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Research progress and prospect of nattokinase

GAO Zexin1,HELaping1,2*,LIU Yabing1,GAO Bing3,LICuiqin4,LIU Hanyu1
(1.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory ofAgriculturaland Animal Products Store&Processing ofGuizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College ofBioengineering and Food Science,HubeiUniversity ofTechnology,Wuhan 430068,China;4.SchoolofChemistry and ChemicalEngineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)

Nattokinase is a kind of alkaline serine proteinasemainly from Bacillus subtilis and iswell known for its strong thrombolytic property. Compared w ithmostofother thrombolytic agents,ithasgood safety,low cost,easy absorption,low side effectsand other advantages,which could be developed as a promising agent for thrombosis therapy.In this paper,the thrombolytic efficacy,physicochemical properties,fermentation process, activity determination,purification,modification and products of nattokinase at home and abroad were reviewed.The key issues in the current research of nattokinasewere analyzed,and the future research direction ofnattokinasewasalso prospected.

nattokinase;thrombolysis;physicochem icalproperties;purification;modification

TS262.3

0254-5071（2017）08-0011-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.003

2017-04-25

貴州省重大專項項目子項目（黔科合重大專項字（[2015]6004-5號））；貴州省農業攻關項目（黔科合支撐（[2016]2580號））

高澤鑫（1993-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：何臘平（1972-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程、生物催化與生物轉化。