聚陽離子誘導纖維內礦化翻開仿生骨修復的新篇章

牛麗娜，陳吉華，宋 群，楊耀東

(1.第四軍醫大學口腔醫院，陜西 西安 710032)(2.西安交通大學，陜西 西安710049)

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聚陽離子誘導纖維內礦化翻開仿生骨修復的新篇章

牛麗娜1，陳吉華1，宋 群1，楊耀東2

(1.第四軍醫大學口腔醫院，陜西 西安 710032)(2.西安交通大學，陜西 西安710049)

近年來，由創傷、腫瘤等因素造成的骨缺損發生率呈上升趨勢，給患者帶來了巨大的痛苦。當缺損量超出自體修復能力時，就需要天然或人工骨替代材料來進行修復。據世界衛生組織報道，全世界每年約有220萬的病人需要進行骨移植修復。在眾多骨缺損修復材料中，自體骨、異體骨是常用的移植材料，但是它們存在來源有限、免疫排斥、病毒傳播等問題，難以滿足臨床需求。另外，異種骨還因抗原性強而應用較少。所以，合成結構功能高度仿生的人工骨再生修復材料是解決這一問題的關鍵。好的修復材料應當盡量“靠近”自然成骨過程，對破損處進行“仿生”修復。

自然骨組織最主要的結構特點就是膠原纖維和羥基磷灰石所形成的纖維內礦化模式和7級分級結構，按照礦物質與膠原的相對位置關系，這些礦物質可分為纖維內礦化和纖維間礦化，其中纖維內礦化決定了骨組織優異的力學特性和生物學特征。在構建人工骨修復材料時，也應盡最大可能地模擬天然骨組織的這種纖維內礦化的結構形式。所以探索纖維內礦化的機制對于指導仿生礦化材料的構建和生物礦化機制的揭示具有重要的意義。

在天然骨組織的形成過程中，非膠原蛋白調控著整個礦化的進程，也成為仿生礦化中仿生的關鍵一步。這些非膠原蛋白最主要的特征是富含羧基，而呈陰離子特性。基于這一特性，傳統的仿生礦化機制認為帶負電的非膠原蛋白(或者非膠原蛋白類似物)穩定鈣磷溶液，形成帶負電荷的礦化前體。基于正負電荷相吸的庫倫引力理論，帶負電荷的礦化前體與帶正電荷的膠原位點間相互吸引，成為纖維內礦化形成的動力。基于這一理論，幾乎所有的體外研究都使用富含羧基的酸性聚合物來模擬非膠原蛋白的功能，并集中于聚陰離子誘導的纖維內礦化上。

第四軍醫大學口腔醫院陳吉華教授和牛麗娜副教授課題組，在前期的研究中，意外的發現聚陽離子也可以穩定鈣磷溶液形成帶正電荷的礦化前體，并能成功誘導帶正電荷的膠原纖維的纖維內礦化(如圖1)。這一實驗現象與傳統的基于庫倫引力的仿生礦化機制相左，提示仿生礦化機制其實存在其他的可能性。

歷時3年，牛麗娜課題組使用鼠尾膠原、重組的牛皮膠原、脫礦的牙本質膠原、脫礦的骨膠原等不同的膠原模型反復印證了聚陽離子誘導纖維內礦化這一實驗現象。通過膠原改性，發現在膠原上增加負電荷，會抑制聚陽離子誘導的纖維內礦化的形成，相反如果膠原上增加正電荷，會促進聚陽離子誘導的纖維內礦化的形成(如圖2)。這一實驗發現，動搖了傳統的基于庫倫引力的仿生礦化機制，顯示原本經典的聚陰離子誘導的纖維內礦化理論并不全面。

圖2 通過交聯法在膠原表面節枝聚陽離子實現膠原的陽離子改性。(a)改性后膠原表面的氨基數量顯著增加，而羧基數量顯著降低(P<0.05)；(b)左圖為陽離子型膠原在聚丙烯氯化銨穩定的鈣磷溶液中僅孵育1天即可發生顯著的纖維內礦化，圖中標尺=500 nm；右圖為高倍鏡下觀察可見羥基磷灰石晶體在膠原纖維內部有序排列，并反映了膠原的橫紋結構，圖中標尺=200 nm

課題組使用改良的液相色譜法證實膠原纖維具有半透膜的性質，小于6 KDa的分子可以自由通過膠原纖維的內部間隙，大于40 KDa的分子無法進入膠原纖維的內部間隙。由于礦化系統中所使用的聚電解質分子量較大，這些分子會被部分或者全部排出在膠原纖維之外，同時由于這些聚電解質帶有大量的電荷，勢必在膠原內外環境間形成Gibbs-Donnan平衡，也就是電荷和滲透壓的雙平衡。

為了印證這一假設，通過使用計算機模擬和液相原子力顯微鏡技術觀察發現，當膠原纖維處于富含高分子量的聚電解質溶液中時，膠原纖維內部的水分流出、膠原收縮、直徑變小，并在膠原內部形成彈性回縮力，當收縮的膠原處于聚電解質穩定的鈣磷溶液中時，會吸引液態的礦化前體進入膠原內部，并在膠原內部不同氨基酸殘基的作用下，從無定型態轉化為結晶態的磷灰石，形成纖維內礦化(如圖3)。這樣的一個機制可以總結為基于滲透壓和電荷平衡的纖維內仿生礦化理論。

該成果在生物礦化機制研究領域中具有里程碑式的意義。聚陽離子誘導纖維內礦化現象的發現不僅打開了仿生礦化材料構建這一新領域的大門，擴大了非膠原蛋白類似物的范圍，更重要的是顛覆了被認為是“圣經”的庫倫引力誘導纖維內礦化的理論，表明單純以庫倫力誘導纖維內礦化理論為基礎，試圖通過增加膠原表面正電荷促進聚陰離子誘導膠原礦化的方法并不完備。課題組提出并反復印證的新的礦化理論——基于滲透壓和電荷平衡的礦化，是更加全面的纖維內礦化的理論。這一新理論提示我們骨組織生物礦化的研究不應該僅僅局限于酸性的非膠原蛋白，大量的堿性蛋白甚至是廣泛存在的蛋白聚糖都有可能影響著生物礦化的進程。

圖3 離子型聚合物(以聚陽離子為例)誘導纖維內礦化的機制示意圖。帶正電荷的大分子陽離子聚合物無法進入膠原內部，在膠原內外逐步形成電荷和滲透壓的雙平衡，從而引起膠原內水分子外流及無定形磷酸鈣前體的內流，進入膠原內部的無定形磷酸鈣在膠原內部不同氨基酸殘基的作用下，從無定型態轉化為結晶態的磷灰石，形成纖維內礦化

鑒于該研究為生物礦化機制的探索提供了強有力的理論支撐，拓寬了生物礦化的研究范圍，該成果近日在NatureMaterials以Article形式發表(DOI:10.1038/nmat4789)。我們相信，基于滲透壓和電荷平衡的纖維內仿生礦化理論，將翻開仿生骨修復的新篇章。

(編輯 蓋少飛)

【編者按】當前，由于疾病、意外事故等原因引起的骨損傷、骨缺失的人數急速攀升。為了緩解和治愈骨組織疾病對患者機體造成的痛苦和功能障礙，人們對骨修復技術的依賴性亦日益俱增。目前骨修復的主要方法有自體骨移植、異體骨移植、人工合成骨移植(仿生骨修復)。其中，自體骨移植來源有限，且會造成患者病愈后的疼痛，對其康復后的行動造成一定的限制；異體骨移植雖然來源較前者豐富，但成本高、加工處理復雜，并且存在免疫排斥、新來源疾病傳播等風險。因此仿生骨修復技術成為該類疾病治愈的關注熱點。近日，第四軍醫大學口腔醫院陳吉華教授和牛麗娜副教授課題組在仿生骨修復技術的研究中意外發現聚陽離子可以穩定鈣磷溶液形成帶正電荷的礦化前體，并能成功誘導帶正電荷的膠原纖維的纖維內礦化。該發現顛覆了庫倫引力誘導纖維內礦化的傳統理論，為探索仿生礦化的新機制提供了可能。目前該成果以Article的形式發表于NatureMaterials。