重癥肌無力患者外周血CD4+T細胞功能的變化及相關機制

郭 淼 張曉鶯 李燕云

(新疆生產建設兵團醫院神經內科，新疆 烏魯木齊 830002)

重癥肌無力患者外周血CD4+T細胞功能的變化及相關機制

郭 淼 張曉鶯 李燕云

(新疆生產建設兵團醫院神經內科，新疆 烏魯木齊 830002)

目的探討重癥肌無力(MG)患者外周血CD4+T細胞功能的變化對其機制。方法抽取初治及治療病情穩定的MG患者及同期入院進行健康體檢者各20例的靜脈血10 ml。流式細胞術(FCM)測定其外周血白細胞介素(IL)-17+CD4+T細胞、干擾素(IFN)-γ+CD4+T細胞、腫瘤壞死因子(TNF)-α+CD4+T細胞、IL-2+CD4+T細胞和CD4+CD25highCD127-Treg細胞比例。CD4+T細胞與CD4+CD25highCD127-Treg細胞共孵育后，FCM術測定CD4 T細胞分泌IL-17、IFN-γ、TNF-α及IL-2變化情況。結果與對照組及治療病情穩定的MG患者相比，初治MG患者外周血IL-17+CD4+T細胞、IFN-γ+CD4+T細胞、TNF-α+CD4+T細胞、IL-2+CD4+T細胞比例均顯著升高(P<0.05)。MG患者與HC外周血CD4+Foxp3+Treg細胞比例比較差異無統計學意義(P>0.05)。對照組外周血CD4+CD25highCD127-Treg細胞可顯著抑制CD4 T細胞分泌IL-17、IFN-γ、TNF-α和IL-2，而MG患者外周血CD4+CD25highCD127-Treg細胞抑制CD4+TT細胞分分泌細胞因子的能力顯著降低。結論MG患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞功能的喪失，致使外周血CD4+T細胞細胞因子分泌能力增強，從而導致MG的發生和發展。

重癥肌無力；外周血淋巴細胞；調節性T細胞

重癥肌無力(MG)是一種器官特異性的自身免疫性疾病，在大多數情況下，MG的發病原因主要是因為體內大量產生針對骨骼肌乙酰膽堿受體(AchR)的高度特異性自身抗體〔1〕。MG自身免疫反應發生的機制目前還不清楚，但胸腺功能異常時(增生、腫瘤)可導致抗AchR的出現〔2〕；同時遺傳因素也與MG的發病密切相關〔3〕。本研究旨在探討MG患者外周血CD4 T細胞功能的變化及其可能機制。

1 材料與方法

1.1分離外周血單個核細胞 收集2015年06月至2016年12月內科住院的初治MG患者及治療病情穩定的MG患者各20例及同期入院進行健康體檢者20例，將5 ml淋巴細胞分離液按1∶1的比例加入5 ml無菌采集的抗凝血中，置于15 ml離心管中，800 r/min離心15 min，吸取白膜層，放置于15 ml離心管(內含10 ml RPMI 1640培養基)，600 r/min離心10 min，用RPMI 1640培養基重懸細胞沉淀物，再次400 r/min離心8 min，最后用含10%胎牛血清(FBS)、200 IU/ml rhIL-2 RPMI 1640培養基重懸細胞沉淀物，臺盼藍染色計數后制備成濃度為2×106個/ml的細胞懸液。

1.2細胞因子檢測方法 將外周血單個核細胞置于1 μg/ml CD3抗體及2 μg/ml CD 28抗體包被的48孔板中，置于37℃、5% CO2培養箱培養72 h，加入1 μg/ml離子霉素及100 ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)刺激1 h后加入，高爾基體阻斷劑，繼續培養5 h，收集細胞，首先進行細胞表面分子CD4染色，然后采用0.5 ml細胞膜固定透化液重懸細胞，室溫下避光封存30 min，然后加入相應熒光抗體〔細胞介素(Foxp3)、白細胞介素(IL)-17、干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α及IL-2〕，室溫避光30 min，0.2 ml 1%多聚甲醛固定液固定后，采用流式細胞儀進行測定。CD4+T細胞與CD4+CD25highCD127-Treg細胞共孵育后細胞因子的檢測，將兩種細胞按1∶1比例置于1 μg/ml CD3抗體及2 μg/ml CD 28抗體包被的48孔板，余步驟同上。

1.3統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1MG患者外周血CD4+T細胞細胞因子分泌能力檢測 外周血(IL)-17+CD4+T細胞、IFN-γ+CD4+T細胞、TNF-α+CD4+T細胞、IL-2+CD4+T細胞比例分別為(0.45±0.13)、(10.37±4.82)、(21.46±6.38)和(16.83±7.03)，初治MG患者分別為(1.38±0.25)、(20.50±3.93)、(33.82±5.92)和(41.58±6.03)，二者相比差異均有統計學意義(t=3.13，12.94，10.27，22.14；均P<0.05)。治療病情穩定MG患者分別為(0.69±0.19)、(14.36±2.62)、(26.35±4.17)和(29.35±4.42)，與初治MG患者相比差異有統計學意義(t=2.94，9.29，11.17，18.41，均P<0.05)。

2.2MG患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞比例檢測 MG患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞比例為(7.98±1.12)%，對照組為(7.88±1.08)%，差異無統計學意義(t=0.09，P<0.05)。

2.3對照組外周血Treg功能與MG外周血CD4 Treg功能比較 對照組外周血CD4+CD25highCD127-Treg細胞與MG外周血CD4+T細胞共孵育后，IL-17+CD4+T細胞、IFN-γ+CD4+T細胞、TNF-α+CD4+T細胞、IL-2+CD4+T細胞比例分別為(0.93±0.14)、(14.20±14.20)、(14.20±4.72)和(27.85±5.38)，差異有統計學意義(t=2.14，10.89，27.19，31.11；均P<0.05)。

3 討 論

本研究提示，CD4+T細胞功能的異常可能與MG的發病密切相關。然而，外周血CD4+T細胞細胞因子分泌能力的增強可能是因為CD4+Treg細胞的免疫抑制功能降低所致。目前，Treg細胞在MG發病中的作用已得到肯定〔4～6〕。因此認為可能是在MG患者外周血中Foxp3+CD4+Treg細胞失去了抑制CD4+T細胞的能力，致使CD4+T細胞分泌大量的炎性因子，最終導致MG的發生。

本研究發現，MG患者外周血CD4+CD25highCD127-Treg細胞功能的喪失，致使外周血CD4+T細胞比例升高，分泌細胞因子IFN-γ、TNF-α的能力增強，導致炎癥擴張，在重癥肌無力的發生過程中起到重要作用。

1Meriggioli MN,Sanders DB.Autoimmune myasthenia gravis:emerging clinical and biological heterogeneity〔J〕.Lancet Neurol,2009;8(5):475-90.

2Roxanis I,Micklem K,Willcox N.True epithelial hyperplasia in the thymus of early-onset myasthenia gravis-patients:implications for immunopathogenesis〔J〕.J Neuroimmunol,2001;112(1-2):163-73.

3Landoure G,Knight MA,Stanescu H,etal.A candidate gene for autoimmune myasthenia gravis〔J〕.Neurology,2012;79(4):342-7.

4Thiruppathi M,Rowin J,Li Jiang Q,etal.Functional defect in regulatory T cells in myasthenia gravis〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2012;1274:68-76.

5Zhang Y,Wang HB,Chi LJ,etal.The role of FoxP3+CD4+CD25hi Tregs in the pathogenesis of myasthenia gravis〔J〕.Immunol Lett,2009;122(1):52-7.

6Sakuma H,Katayama A,Saito Y,etal.CD4+ CD25(high)regulatory T cell in childhood ocular myasthenia gravis〔J〕.Brain Dev,2011;33(5):442-4.

李燕云(1975-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事神經內科研究。

郭 淼(1979-)，男，主治醫師，主要從事眩暈的診治研究。

R746.1

A

1005-9202(2017)20-5011-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.024

〔2017-05-09修回〕

(編輯 袁左鳴)