鐵皮石斛內生菌研究進展

龔 鶯，何伯偉，王淑珍，毛碧增*

(1.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省中藥材產業協會 浙江 杭州 310020；3.杭州市農業科學研究院 浙江 杭州 310058)

鐵皮石斛內生菌研究進展

龔 鶯1，何伯偉2，王淑珍3，毛碧增1*

(1.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州 310058； 2.浙江省中藥材產業協會 浙江 杭州 310020；3.杭州市農業科學研究院 浙江 杭州 310058)

鐵皮石斛作為蘭科石斛屬的一種珍貴藥材，其生長與內生菌密不可分。目前已從生長在不同環境下的鐵皮石斛中分離得到多種真菌和細菌，部分菌株對植株具有顯著的促生作用。詳細總結鐵皮石斛內生菌的多樣性、內生菌對宿主作用的研究結果，展望了今后的研究方向。

鐵皮石斛； 內生真菌； 內生細菌； 促生作用

植物內生菌是指在健康植物中度過近乎全部的生命周期，對寄主植物產生一定間接或直接作用的一類微生物，主要包括真菌和細菌。一方面，寄主植物可為內生菌提供生存所需的環境、營養和能量；另一方面，內生菌依靠自身的生命代謝活動對寄主植物產生影響[1]。已有研究表明，植物內生菌有促進植物生長[2]、增強宿主氮吸收[3]、提高植物抗逆性[4]、提高抗病性[5]等作用。

鐵皮石斛是蘭科石斛屬草本植物，是我國傳統名貴中藥，為中華“九大仙草”之首，《中華人民共和國藥典》2010版特將鐵皮石斛單獨收載[6]?！吨腥A人民共和國藥典》2015版記載鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱的功效，主要用于治療熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨癱軟[7]。因其廣泛的藥用價值和顯著的藥用效果，鐵皮石斛已成為制藥的主要原料之一。以鐵皮石斛(楓斗)為原料的保健食品，全國生產企業55家，產品88個，其中浙江省生產企業15家，產品55個，主要劑型有顆粒劑、膠囊片劑、口服液、浸膏、飲料等。鐵皮石斛在制藥中的應用也使得其原料的需求量急劇上升。2015年全國種植面積達0.467萬hm2，其中浙江省種植面積達2 333 hm2。鐵皮石斛被譽為我國民族健康產業和保健食品的典型代表，贏得與人參、靈芝、冬蟲夏草同等的市場地位。

中藥講究道地性，即指在一定自然條件、生態環境的地域內所產的藥材，因特有的水土、氣候、日照、生物分布等，保證了藥材的質量[8]。道地藥材的形成有三大因素，即生物因素、環境因素和人為因素[9]。野生鐵皮石斛多附生于巖石或松木上，并與內生菌共生生長，是影響其藥性的因素之一。人工栽培脫離原有生態環境，藥材品質與野生型存在一定差異。為探究生物條件的影響，學者們在內生菌對提高鐵皮石斛自然成活率、提升組培苗質量、穩定藥理作用等方面進行了大量研究，對促進產業發展具有一定的意義。本文著重對鐵皮石斛內生菌的多樣性和對宿主的生理協同作用進行全面系統總結，以期對內生菌更深入的研究和鐵皮石斛產業更好的發展提供一定理論依據。

1 鐵皮石斛內生真菌的多樣性

鐵皮石斛內生真菌資源豐富，目前從不同生境下(四川、云南、福建、河南、廣西、湖南、安徽、浙江等)的鐵皮石斛中均已發現多種內生真菌，包括擔子菌亞門、半知菌亞門和子囊菌亞門的57個屬[10-21]。郭順星等[11]從四川、云南、福建的野生鐵皮石斛根部分離得到內生真菌14株，分屬于柱孢霉屬(Cylindrocarpon)、支頂孢霉屬(Acremonium)、瘤菌根菌(Epulorhiza)等11個屬；趙昕梅等[12]從河南野生鐵皮石斛根部分離得到4株鐮孢菌屬(Fusarium)和柱霉菌屬(Scytalidium)的內生真菌；帥紅艷[13]從廣西環江產野生鐵皮石斛根中分離得到37株內生真菌，分屬于鐮孢菌屬、頭孢霉屬(Cephalosporium)、擬小卵孢屬(Ovulariopsis)等，其中18株真菌具有一定的抗菌活性；毛益婷等[14]從廣西樂業雅長蘭科植物自然保護區和湖南茛山世界自然遺產風景名勝區的鐵皮石斛根中分離得到41株內生真菌，分屬于毛殼菌屬(Chaetomium)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、間座殼屬(Diaporthe)等20個屬，34個種；吳慧鳳等[15]也從湖南茛山鐵皮石斛根部組織中分離得到37株內生菌，其中26株為致病菌，11株為非致病菌，非致病菌中有9株為促生菌，這些促生菌分屬于小球殼屬(Mycosphaerella)、瘤菌根菌屬、球座菌屬(Guignardia)等。

對鐵皮石斛內生真菌的研究不僅僅局限于根部，對莖和葉中的內生真菌也有一定研究。胡克興等[16]從云南野生鐵皮石斛的根、莖、葉中分離得到67株內生真菌，其中根部內生真菌分布最多。通過對產孢真菌進行形態學鑒定，認為其分屬于鐮孢菌屬、鏈格孢屬(Alternaria)、支頂孢屬等11個屬；對不產孢真菌進行ITS分子鑒定，認為其分屬于白粉寄生孢屬(Ampelomyces)、節菱孢屬(Arthrinium)等7個屬。嚴亮等[17]從云南野生鐵皮石斛根、莖、葉中共分離得到16株真菌，分屬于脈孢菌屬(Neurospora)、糞殼菌屬(Sordaria)、毛殼菌屬等9個屬。郁陽等[18]從安徽地區野生鐵皮石斛根、莖、葉中分離得到11株內生真菌，分屬炭疽菌屬(Colletotrichum)、赤殼屬(Cosmospora)、鐮孢菌屬等5個屬，其中莖部內生真菌分布最多。陳澤斌等[19]采用高通量測序技術發現裸胞殼屬(Emericella)是云南普洱市野生鐵皮石斛葉片中內生真菌的優勢種群。李俊峰等[20]從浙江溫州雁蕩山野生鐵皮石斛根、莖、葉中分離得到31株內生菌，真菌22株，莖部內生菌分布最多。5株真菌對大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)有抑制作用，其中TG2的抑菌效果最佳，同時經乙酸乙酯萃取得到的發酵代謝產物具有較強的抗腫瘤活性。陳玉棟等[21]從人工培育的三年生健康鐵皮石斛根、莖、葉中共分離得到30株內生真菌，根部內生真菌分布最多，其中鐮孢菌屬和曲霉屬(Aspergillus)為優勢菌種。

不同生長環境和不同植物器官使得鐵皮石斛根部內生真菌種類出現了較多差異，可能與環境濕度、溫度等因素有關。從廣西和湖南野生鐵皮石斛根部分離得到較多菌種，主要為半知菌亞門和子囊菌亞門真菌；云南和浙江溫州野生鐵皮石斛中也存在較多內生真菌，且根部和莖部的內生真菌相較于葉部更豐富。人工養殖培育的鐵皮石斛中同樣存在較多內生真菌，說明鐵皮石斛與內生真菌密不可分。

2 鐵皮石斛內生細菌的多樣性

對鐵皮石斛內生菌的研究始于真菌，近年來對內生細菌也有較多研究，分離得到的細菌種類較為豐富，涵蓋了厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和梭桿菌門的50個屬[16,22-26]。張萍[22]從湖南野生鐵皮石斛根部分離得到19株內生細菌，其中6株為促生菌，分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、蒼白桿菌屬(Herbaspirillum)、腸桿菌屬(Enterobacter)等5個屬，其對種子的萌發、原球莖的生長、鐵皮石斛組培苗有顯著的促進效果，同時具有一定的固氮、解磷、產鐵載體和分泌IAA的功能。俞婕[23]從蕭山、奉化、慶元采集的鐵皮石斛根部和莖部分離出134株內生細菌，并從中篩選出11株優勢菌種，其中9株為芽孢桿菌屬細菌，具有一定淀粉酶、卵磷脂酶和固氮酶活性。章華偉等[24]從浙江天臺山采集的野生鐵皮石斛根、莖、葉中共分離得到23株內生菌，經過鑒定分屬于土壤桿菌屬(Agrobacterium)、芽孢桿菌屬、泛菌屬(Pantoea)等7個屬。周小風等[25]采用傳統分離法和PCG-DGGE法首先研究了鐵皮石斛不同組織中內生菌的分布，發現根部分離得到22株細菌，主要為芽孢桿菌屬細菌；莖部分離得到22株細菌，主要為伯克氏菌屬(Burkholderiaceae)細菌；葉部分離得到17株細菌，主要為假氨基桿菌屬(Pseudaminobacter)細菌。其次研究了不同種植基地對鐵皮石斛內生細菌多樣性的影響，發現從溫州鐵皮石斛中分離鑒定44株細菌，分屬于短波單胞菌屬(Brevundimonas)、假氨基桿菌屬等19個屬。從麗水慶元鐵皮石斛中分離鑒定了42株細菌，分屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)等16個屬。從蕭山鐵皮石斛中分離鑒定了40株細菌，分屬類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、伯克氏菌屬等22個屬。從奉化鐵皮石斛中分離鑒定了50株細菌，分屬于細桿菌屬(Microbacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)等23個屬。從溫州野生鐵皮石斛中分離鑒定了17株細菌，分屬13個屬，從麗水慶元野生鐵皮石斛中分離鑒定了11株細菌，分屬4個屬。野生鐵皮石斛中分離得到了寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、草螺旋菌屬(Herbaspirillum)、泛菌屬等5個有別于人工鐵皮石斛內生菌的菌屬，這些菌屬具有固氮、解磷脫硫、促生等功能。胡克興等[16]從云南野生鐵皮石斛中分離得到28株細菌，分屬于芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)等10個屬。王明月等[26]從人工種植的二年生鐵皮石斛中分離得到49株內生細菌，其中根中分離得到24株，莖中分離得到15株，葉中分離得到10株，熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)、環形芽孢桿菌(Bacillusaxarquiensis)為優勢菌種。

鐵皮石斛不同組織中內生菌多樣性的研究和不同生長環境對鐵皮石斛內生菌多樣性的研究發現芽孢桿菌屬細菌為主要菌種，同時人工培育的鐵皮石斛中亦存在大量芽孢桿菌屬細菌，說明該屬細菌在鐵皮石斛生活史中發揮了重要的作用。

3 鐵皮石斛內生菌對宿主的作用

植物內生菌在一定階段或全階段生存于植物體內，與植物形成一種互利共生的關系。鐵皮石斛為蘭科植物，內生菌在其生長過程中發揮了重要的作用。吳慧鳳等[15]將湖南野生鐵皮石斛中分離得到的非致病菌與鐵皮石斛共培養，菌種促生效果顯著，部分菌種使接菌苗鮮質量增長率高出對照組30%，出芽數高出對照組80%～140%。俞婕等[27]從浙江桐廬鐵皮石斛中分離得到10株內生細菌，其中ZJSH1菌株的102稀釋菌劑能均勻附著在培養基上并促進組培苗生長，同時該菌株接種共生后的鐵皮石斛組培苗平均干重比對照組高15.9%。俞婕等[28]也從浙江奉化鐵皮石斛中分離得到內生細菌52株，其中部分菌株具有蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶和一定的固氮活性。趙昕梅等[12]從河南野生鐵皮石斛中分離得到4株鐮孢菌屬和柱霉菌屬的內生真菌，并通過發酵液噴施的方法篩選得到1株促生菌，該菌株對鐵皮石斛組培苗具有顯著的促生作用，其成活率提高30.43%，植株高度增加31.21%，鮮重增加40.61%。張萍等[29]從鐵皮石斛中分離得到19株內生細菌，其中6株為促生菌，對鐵皮石斛種子萌發、原球莖和組培苗生長有較好促生效果。將這6株促生細菌與8株促生真菌進行非拮抗篩選，在25組非拮抗組中篩選獲得6組處理，新根數、根分枝率、分蘗數和凈鮮重都顯著高于單一菌種處理組。董金海等[30]從安徽霍山鐵皮石斛中分離得到NL-215菌株，與鐵皮石斛組培苗共生培養后發現該菌株有明顯的促生長作用，組培苗各項指標均有顯著增加，接菌苗凈增重量為對照的2.63倍，株高為對照的1.25倍，分株數為對照的1.14倍，根數為對照的1.27倍，新增葉數為對照的1.29倍，新芽數為對照的2.06倍，葉綠素a增加38.28%，葉綠素b增加43.93%，總葉綠素含量為對照的1.41倍，多糖含量增加45.93%。侯曉強等[31]從石斛屬植物中分離得到36株內生真菌，并篩選得到8株促生菌，其對鐵皮石斛組培苗的鮮重、莖粗、新根新芽數量等生理指標都有一定程度的促進作用，部分菌株表現顯著促生作用。朱波等[32]將從活樹附生的鐵皮石斛中分離得到的真菌接于組培苗中共培養，采用苯酚-硫酸法、熱浸法，并結合HPLC，綜合篩選發現4株菌種可提高根數、葉數、莖粗等農藝性狀，促進鐵皮石斛莖節變紫，總多糖含量分別提高113.7%、70.7%、196.0%、157.4%，極顯著高于對照組。這些研究說明，內生菌對鐵皮石斛的生長有促進作用，且對品質也有提高，同時真菌和細菌的共同作用較單一菌株有一定優勢。

4 展望

鐵皮石斛具有很高的藥用價值，因其生長速度慢、種子自然萌發率低等原因，近年來對其有較多的研究。內生菌與植物的生長密不可分，鐵皮石斛作為蘭科植物的一種，其生長與菌根真菌存在聯系[33]，因此對鐵皮石斛內生菌的研究也越來越多。目前對鐵皮石斛內生菌的研究主要為內生菌的分離鑒定、內生菌的多樣性以及促生菌的篩選。在研究范圍和研究深度上還有欠缺。傳統內生菌的分離鑒定為組織塊分離法、形態學鑒定和分子水平鑒定結合。陳澤斌等[19，25]突破傳統方法，利用高通量測序技術、PCG-DGGE法，鑒定獲得大量菌種，為提高菌種鑒定的準確性提供了良好的借鑒。促生菌的篩選均選用組培苗進行研究，缺乏盆栽試驗以及田間試驗應用。同時，對促生作用研究大部分局限于菌體定殖共培養和菌液噴灑灌溉，對菌體代謝產物研究較少。鐵皮石斛具有抗腫瘤、提高免疫力等藥理作用，其內生菌代謝產物是否也具有這些作用值得更深入的研究。另外，內生菌的作用研究僅以促生為主，還可進行其他方面的探索，比如病害防治、污染治理等。鐵皮石斛內生菌的研究將為提高鐵皮石斛自然生長率、提高有效物質積累以及后續藥理研究提供重要參考價值。

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(責任編輯：張瑞麟)

2017-05-22

浙江省公益性技術應用研究專項(2014C32099)；浙江省“三農六方”科技協作計劃項目(ZJ-SN-201409)；浙江省農業中藥材新品種選育重大科技專項(2016C02058-3)

龔 鶯(1993—)，女，浙江杭州人，在讀碩士，從事植物病害研究工作，E-mail: gyygrace904@126.com。

毛碧增，研究員，博士，從事植物生物技術、中藥材品種選育與品質改良工作，E-mail: maobz@zju.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170825

S567

A

0528-9017(2017)08-1372-04

文獻著錄格式：龔鶯，何伯偉，王淑珍，等. 鐵皮石斛內生菌研究進展[J].浙江農業科學，2017，58(8)：1372-1375.