水熱預處理提高花生分離蛋白酶解效率及其機理分析

陳 林，陳建設，于泓鵬，吳克剛※

（1. 廣東工業大學輕工化工學院食品系，廣州 510006；2. 浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州 310018）

水熱預處理提高花生分離蛋白酶解效率及其機理分析

陳 林1，陳建設2，于泓鵬1，吳克剛1※

（1. 廣東工業大學輕工化工學院食品系，廣州 510006；2. 浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州 310018）

為了提高花生分離蛋白的酶解效率，該文采用水熱法對花生分離蛋白進行預處理，利用響應面試驗設計優化預處理工藝，并研究比較了預處理前后花生分離蛋白酶解敏感性和空間構象的變化。結果表明：優化后的最佳預處理條件為水熱壓力90 MPa、水熱溫度85℃、水熱時間20 min，此條件下酶解產物水解度達到16.3%，相對未經預處理的酶解產物提高了 8 .1個百分點。水熱預處理提高了花生分離蛋白的主要組分花生球蛋白和伴球蛋白的酶解敏感性，使酶解產物蛋白質回收率提高了31.9個百分點。進行熒光光譜和紅外光譜分析發現水熱預處理使花生分離蛋白三級結構展開、二級結構緊密程度下降，可能是其酶解敏感性提高的主要原因。因此水熱預處理是一種輔助提高花生分離蛋白酶解效率行之有效的方法。

蛋白；熱處理；優化；水熱預處理；花生分離蛋白；酶解敏感性；空間構象

0 引 言

花生蛋白是中國大宗優質植物蛋白資源，具有較高的營養效價和豐富的功能特性。花生分離蛋白（peanut protein isolate，PPI）是一種花生蛋白的精制產品，蛋白質量分數在90%以上，是一種重要的食品工業基礎原料。其中主要的蛋白質組分為花生伴球蛋白和花生球蛋白，約占PPI總蛋白含量的90%[1]。目前國內PPI的產量不斷增加，然而市場對于傳統PPI的需求已趨于飽和，由于商品化 P PI的溶解性較差，導致其在食品和非食品領域的應用受到限制[2]。國外已對PPI的分子結構、功能特性、改性技術等進行了大量而深入的研究，美國和日本已利用PPI開發出了蛋白乳化劑、降血壓多肽、可食性膜等深加工產品，但這些技術基本沒有申請專利，屬于技術機密，對中國PPI生產技術的研究幫助較少[3-4]。探索花生蛋白改性技術及改善其功能特性，對開辟花生蛋白新的利用途徑，提高其使用價值，滿足人們健康需求，具有重要意義。

蛋白質酶解是利用蛋白水解酶在溫和條件下催化蛋白質水解成氨基酸和小肽。酶解反應速度快、條件溫和、專一性強、無氨基酸破壞和有害物質產生，故被認為是水解食品蛋白的最佳方法[5-6]。蛋白質經適度酶解后除了保留甚至提高其生物價外，功能特性明顯優于原始蛋白質[7-8]；利用蛋白酶解制備生物活性肽更是成為國內外研究的熱點[9-10]。然而由于花生蛋白特殊的組成和結構，蛋白分子高度壓縮、結構緊密，對蛋白酶的水解作用有很強的抵抗力，導致酶解反應速度慢、產物水解度低、酶解不徹底等問題，大大制約了花生蛋白酶解改性的實際效果[11-13]。因此尋求花生蛋白高效酶解技術是花生蛋白改性的關鍵。

水熱處理是在密閉的壓力容器中（如高壓反應釜），在高壓條件下對蛋白樣品進行加熱處理[14]。據報道，在水熱處理過程中蛋白質同時經歷高溫、高壓兩種作用導致其分子結構發生顯著變化[15-19]。如葉榮飛等[15]研究發現水熱處理可破壞大豆蛋白的內部基團，導致其亞基解離，從而使蛋白溶解性顯著提高。Tedford等[16-17]發現與常壓熱處理相比，水熱處理中高溫和高壓相聯合對維持β-乳球蛋白高級結構的次級鍵和二硫鍵有協同增效的破壞作用，因此使其分子結構發生了更為顯著的變化。水熱處理可破壞蛋白質的高級結構，誘導蛋白亞基解離，有可能使被包埋的酶解位點暴露，提高蛋白的酶解敏感性。然而針對花生蛋白，以往的研究多集中在水熱處理對蛋白功能特性的影響，而水熱處理后花生蛋白酶解特性的變化研究報道的很少。因此本文旨在研究水熱預處理對PPI酶解特性的影響，并通過研究比較預處理前后PPI及其酶解產物理化性質和結構的變化，探討水熱處理提高PPI酶解敏感性的潛在機理。闡明該機理對提高花生蛋白的酶解效率、改善其功能特性具有重要的理論和現實意義，可為花生蛋白深加工提供理論和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生分離蛋白（蛋白質量分數為92.7%±0.7%，干基），青島長壽食品有限公司；復合蛋白酶Protamex（酶活力為 1 .5 AU/g），丹麥諾維信公司；其他試劑均為國產分析純。

高壓反應釜（CJ-200，威海新元化工機械有限公司）；自動電位滴定儀（TIM840，美國Radiometer公司）；電泳系統（Mini-protean IV，美國Bio-Rad公司）；熒光分光光度計（FluoroMax-4，法國HORIBA Jobin Yvon公司）；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 6700，美國Thermo fisher公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 響應面試驗設計優化水熱預處理工藝

將PPI分散到去離子水中配制成50 g/L的分散液，常溫下（25℃左右）攪拌2h使其充分分散，然后置于CJ-200高壓反應釜中進行水熱預處理，處理過程中設定攪拌速率為20 r/min。通過單因素預試驗發現水熱處理壓力（X1）、溫度（X2）和時間（X3）為影響酶解產物水解度（degree of hydrolysis，DH）的3個主要因素，并確定了它們適宜的水平范圍。響應面法優化試驗（response surface methodology，RSM）根據螺旋中心組合設計原理，采用軟件Design-expert 8.0.6中Box-Behnken模型進行三因素三水平試驗，以 D H為響應值，各因素水平如表1所示。水熱處理后的PPI樣品（hydrothermally cooked PPI，HPPI）立即進行蛋白酶水解。部分樣品經真空冷凍干燥（真空度為15 Pa，冷阱溫度為-60 ℃）得到粉末，粉碎后過60目篩，于密閉干燥容器中保藏備用。

表1 響應面試驗設計中水熱預處理工藝各因素和水平編碼表Table 1 Coded settings of process parameters for hydrothermal pretreatment in RSM

1.2.2 蛋白酶解反應及水解度的測定

為了識別水熱預處理后花生蛋白暴露出的酶解位點，本文采用酶切位點比較廣泛的復合蛋白酶Protamex[20]，酶解過程如下：將樣品分散液調節至Protamex的最適酶解pH值（6.8），并將恒溫水浴溫度調節至最適酶解溫度（50 ℃）。啟動磁力攪拌器，預熱10 min，然后加入Protamex開始酶解，蛋白酶/底物比例為0.5%（質量比）。酶解過程采用自動電位滴定儀自動滴加0.2 mol/L NaOH溶液入樣品分散液，從而維持酶解過程中樣品pH值在6.8±0.1。酶解120 min后，記錄堿液消耗量，采用pH-stat法測定DH[20]。酶解液于95 ℃水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫（25 ℃左右）后備用。部分樣品經真空冷凍干燥（真空度為15 Pa，冷阱溫度為-60 ℃）得到粉末，粉碎均勻后過60目篩，于密閉干燥容器中保藏備用。

1.2.3 蛋白質回收率（protein recovery，PR）的測定

樣品酶解液經4 000×g離心20 min，取上清液。采用半微量凱氏定氮法測定上清液中蛋白質含量。蛋白質回收率（PR）的計算公式為：PR=[樣品中水溶性蛋白質量(g)/樣品中總蛋白質量(g)]×100%。

1.2.4 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參照Laemmli報道的方法[21]，濃縮膠質量分數為4%，分離膠為質量分數4%～15%的梯度膠。將冷凍干燥后的蛋白樣品溶解于樣品緩沖液（0.0625 mol/L Tris-HCl buffer （pH值6.8），20 g/L SDS，5%（體積分數）巰基乙醇，25%（體積分數）甘油和0.1 g/L 溴酚藍）中配置成質量濃度為10 mg/mL的分散液。95 ℃下水浴加熱5 min，離心后（4 000×g，20 min）取上清液。每個樣品的上樣量為10 μL。凝膠電泳在恒壓下進行，在濃縮膠中的電壓為60 V，進入分離膠后增至120 V。電泳結束后，采用考馬斯亮藍（R-250）對凝膠染色，再用甲醇和醋酸混合液脫色，最后在凝膠成像系統中進行成像處理。蛋白標準品的分子量為14.4～97.4 kDa。

1.2.5 熒光光譜分析

將蛋白樣品用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH值7.0）配制成質量濃度為0.15 mg/mL的溶液。熒光發射光譜分析以蛋白分子中的熒光基團（色氨酸殘基）為探針[22]。為了降低酪氨酸的干擾，以295 nm為激發波長，在300～400 nm范圍內進行掃描，激發和發射狹縫寬均為5 nm，以緩沖液作為空白。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

稱取冷凍干燥后的蛋白樣品2～6 mg，加入0.2 g左右的KBr，一起研磨混制均勻，壓片，平衡2 min。以干燥空氣為背景，采用紅外附件 A TR（衰減全反射）將蛋白樣品在傅里葉紅外光譜儀上做全波段（4 000～400 cm-1）掃描，掃描次數為32次，分辨率為4 cm-1。參照Cruz-Angeles等[23]的方法，用PeakFit v4.12軟件對位于1 600～1 700 cm-1波段屬于酰胺I帶特征峰的圖譜進行分析。校正基線，采用Gaussian去卷積，由二階導數擬合，多次擬合使殘差最小。根據子峰面積計算各部分二級結構的相對含量。其中各子峰與二級結構對應關系為：1 615～1 637 cm-1、1 682～1 700 cm-1為β-折疊；1 648～1 664 cm-1為α-螺旋；1 637～1 648 cm-1為無規則卷曲；1 664～1 681 cm-1為β-轉角[24]。

1.2.7 數據分析

試驗中所有數據都是3次測定的平均值，通過SPSS 13.0進行方差分析，采用Duncan多重范圍檢驗，P＜0.05時表明差異顯著。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗設計結果分析及模型擬合

根據 B ox-Benhken的中心組合設計原理，設計了三因素三水平的二次回歸旋轉正交試驗，共17個試驗點，其中12個為析因點，5個為0點，析因點為自變量取值在水熱壓力（X1）、水熱溫度（X2）、水熱時間（X3）所構成的三維頂點，0點為區域的中心點，0點重復5次，用以估算試驗誤差，試驗設計方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken設計方案及試驗結果Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental results

運用Design-expert 8.0.6軟件對試驗數據進行回歸擬合，得到響應值Y0（水解度，%）對試驗因素X1（水熱壓力，MPa）、X2（水熱溫度，℃）、X3（水熱時間，min）的回歸方程為：

對該回歸方程進行方差分析，結果見表3。回歸方程模型F檢驗非常顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.1），決定系數R2=0.97＞0.95，說明其他因素對試驗結果干擾較小，試驗誤差小，該回歸方程與實測值擬合度高，可以用該模型來分析和預測水熱預處理條件對PPI酶解產物DH的影響。此外，由表3中F值大小可知，本試驗三因素對響應值DH的影響主次順序為：X1（水熱壓力）＞X3（水熱時間）＞X2（水熱溫度），即水熱預處理壓力對DH的影響最為顯著。

根據回歸模型做出相應的響應面圖，即分別將模型中X1、X2和X3中的一個因素固定在0水平，可得到另外兩個因素對DH的交互影響。由表3可知，X1X2間交互作用顯著（P＜0.05），而X1X3和X2X3間交互作用不顯著（P＞0.05），即水熱壓力（X1）與水熱溫度（X2）對水解度（Y0）存在顯著的交互作用。由圖1可見，隨著預處理各因素水平增大，DH呈現出先增加后降低的趨勢，最大值集中在中心區域。這可能是因為水熱預處理過程中，PPI同時受到高溫、高壓的作用，其蛋白質高級結構和分子間聚集狀態發生改變，緊密的結構松散開，暴露出更多的酶解位點，從而使PPI的酶解敏感性提高；然而若水熱處理條件過度，會使展開的蛋白分子因疏水相互作用或形成-S-S-重新聚集成致密的網狀結構，酶解位點反而被包埋[15-19]。響應面模型預測的最優水熱預處理條件為水熱壓力90.57 MPa、溫度86.56 ℃、時間20.99 min，在此條件下預測DH可達到16.2%。為檢驗優化結果的可靠性，對以上試驗結果進行了近似驗證試驗，考慮到試驗可操作性，以減少能耗和反應時間為基準，選擇水熱壓力90 MPa、溫度85 ℃、時間20 min條件下進行3次平行驗證試驗，實際測定DH為16.3%±0.2%，驗證試驗測得數據與預測值無顯著差異（P＞0.05），且顯著（P＜0.05）高于未經預處理酶解產物的DH 8.2%±0.2%，提高了8.1個百分點，再次證明 B ox-Behnken模型適用于優化該反應條件，優化結果準確可靠，具有實用價值。

表3 響應面模型的回歸方差分析Table3 Analysis of variance of regression equation for response surface quadratic model

圖1 水熱壓力與水熱溫度交互作用對PPI酶解產物水解度影響的響應面圖Fig.1 Interactive effects of hydrothermal pressure and hydrothermal temperature on response degree of hydrolysis of PPI hydrolysate

2.2 水熱預處理對PPI酶解敏感性的影響

由響應面試驗設計結果分析可知水熱預處理壓力是影響PPI酶解產物水解度的最主要因素，因此本試驗通過研究PPI酶解產物（PPI hydrolysate，PPIH）和HPPI酶解產物（hydrothermally cooked PPI hydrolysate，HPPIH）的亞基降解、水解度（DH）和蛋白質回收率（PR），分析水熱預處理對PPI酶解敏感性的影響。圖2展示了對照PPI、HPPI（水熱壓力為65～105 MPa，水熱溫度為85℃，水熱時間為20 min）、PPIH和HPPIH的SDS-PAGE圖譜。對照PPI含有5條顏色較深的亞基條帶（S1～S5）。通過分子量標記計算其分子量，并與文獻報道的花生蛋白的亞基組成進行比對，結果發現S1（64 kDa）為花生伴球蛋白（conarachin），S2～S4（40，39，37 kDa）為花生球蛋白（arachin）中的酸性亞基，S5（25 kDa）為花生球蛋白中的堿性亞基[11-13]。與對照PPI相比，經不同壓力水熱處理后，HPPI中各亞基條帶都有所消褪，并伴隨著一系列較低分子量蛋白多肽的生成。進一步測定HPPI的DH發現，HPPI-65 MPa、HPPI-90 MPa、HPPI-105 MPa的DH分別為1.7%、2.8%、3.0%，而對照PPI的DH僅為0.2%（見表4）。這表明在水熱處理下，花生蛋白發生了一定程度的自發水解。這一發現與之前的一些研究報道相似，如Tedford等[16-17]、Wang等[18]也都發現食品蛋白在高溫高壓聯合作用下會發生輕度水解。這可能是因為在蛋白質的自發水解反應中，水解速率與反應體系的溫度和壓力呈正相關，即高溫高壓條件會加速蛋白的自發水解反應[17]。

圖2 水熱預處理前后花生分離蛋白及其酶解產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.2 Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis profiles of hydrothermally pretreated peanut protein isolate and their hydrolysates

經過Protamex酶解后，對照PPI中不同亞基表現出不同的酶解敏感性。在PPIH中，花生伴球蛋白（S1）條帶基本完全消失，而花生球蛋白的酸性亞基（S2～S4）和堿性亞基（S5）均未被完全酶解。由此可見，花生蛋白中的酸性亞基和堿性亞基對Protamex的酶解作用有較強的抵抗力，這與之前文獻報道一致[11-13]。與之相對照的是，HPPIH中花生伴球蛋白和花生球蛋白酸性亞基條帶已經完全消失，且HPPIH-90 MPa和HPPIH-105 MPa中花生球蛋白的堿性亞基也僅有少量殘留。這說明經過水熱預處理后，PPI的主要組分花生球蛋白和伴球蛋白的酶解敏感性明顯提高了。據報道，水熱處理過程中高壓和高溫相聯合對維持蛋白質高級結構的次級鍵和二硫鍵有協同增效的破壞作用，可使球蛋白分子的致密結構展開，甚至可使已變性聚集的蛋白分子變得松散，從而暴露出原來被掩蔽的酶解位點[15-19]。

表4展示了不同壓力水熱預處理后PPI、HPPI、PPIH和HPPIH的DH和PR。本研究采用的商品化PPI在制備過程中經歷了噴霧干燥等高溫處理，可能發生了變性聚集[25]，導致蛋白質回收率較差（對照PPI的PR為17.6%）。經水熱處理后，HPPI的PR顯著提高（P＜0.05），HPPI-90 MPa的PR為27.5%。Wang等[13]也發現熱變性大豆分離蛋白經水熱處理（90 MPa，154℃，4 min）后，PR由13%提高到了35%，這表明水熱處理對已變性聚集蛋白產品的PR有明顯的改善作用。酶解后PPIH和HPPIH的DH和PR都增加了。然而與PPIH相比，HPPIH的DH和PR明顯更高。當水熱壓力為90 MPa時，HPPIH的DH和PR分別達到了16.3%和73.4%，顯著高于 P PIH（DH=8.2%，PR=41.5%）（P＜0.05），其中PR提高了31.9個百分點。這可能是因為水熱預處理提高了PPI主要組分花生球蛋白和伴球蛋白的酶解敏感性，使Protamex對PPI的酶解作用不僅變得強烈（DH更高），而且更加廣泛（PR更高）：在相同的酶解條件下，有更多的花生蛋白在水熱預處理后可被Protamex酶解而變得可以溶解。

表4 水熱預處理對花生分離蛋白及其酶解產物水解度和蛋白質回收率的影響Table 4 Effects of hydrothermal pretreatment on degree of hydrolysis and protein recovery of peanut protein isolate and its hydrolysate

2.3 水熱預處理對PPI空間構象的影響

蛋白質的空間構象與其酶解敏感性密切相關。本研究采用熒光光譜和紅外光譜分析水熱預處理前后 P PI空間構象的變化，試圖從分子水平上解析水熱預處理提高PPI酶解敏感性的潛在機理。

2.3.1 熒光光譜分析

本研究采用295 nm作為激發波長，所得到的是色氨酸（Trp）殘基為發射基團的熒光光譜，其熒光強度和最大吸收波長反映了Trp殘基所處微環境的變化[13,22,26]。當蛋白質三級結構展開時，內部的Trp殘基暴露于極性環境中，最大吸收波長增大（即紅移）[13,22]。水熱預處理前后PPI的熒光發射光譜如圖3所示。對照PPI具有323 nm處的最大熒光發射峰和332 nm處的副峰，表明Trp殘基主要位于PPI結構內部，因為包埋于蛋白質分子內部的Trp殘基的熒光發射峰通常在323～335 nm之間[22,26]。與PPI相比，HPPI在323 nm處的熒光峰強度明顯減弱，負峰則紅移至339 nm且強度明顯增加，這表明水熱處理使PPI中Trp殘基所處的微環境極性增加（包埋于蛋白內部的Trp殘基暴露于水溶液中），意味著PPI的三級結構展開，之前被掩蔽的酶解位點也很可能因此暴露出來。此外，隨著水熱壓力的增大，339 nm處的熒光峰強度先增加，然后稍稍下降，這說明水熱處理壓力對PPI三級結構的松散程度有重要影響。

圖3 水熱預處理對花生分離蛋白內源熒光發射光譜的影響Fig.3 Influences of hydrothermally pretreatment on the intrinsic emission fluorescence spectra of peanut protein isolate

2.3.2 紅外光譜分析

蛋白質紅外光譜中酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）頻率的遷移與蛋白質二級結構密切相關[27]。如圖4a所示，將對照PPI紅外光譜中酰胺I帶進行Gaussian去卷積、二階導數擬合，得到 6 個子峰，分別歸屬為蛋白二級結構中的4種構象：α-螺旋（1 658 cm-1）、β-折疊（1 619 cm-1、1 632 cm-1、1 685 cm-1）、β-轉角（1 671 cm-1）和無規則卷曲（1 645 cm-1）[24]。通過計算每種構象的峰面積與酰胺I帶的總峰面積之比即可得到每種構象所占的百分含量。由表5可見，對照PPI二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲的含量分別為24.6%、36.2%、21.3%、17.9%。此結果與之前的文獻報道相似，表明PPI含有較多的α-螺旋和β-折疊結構[28]。經過水熱處理后，HPPI中α-螺旋和β-轉角的含量顯著（P＜0.05）降低，而β-折疊和無規則卷曲的含量顯著（P＜0.05）升高。在蛋白質二級結構中，無規則卷曲與其他幾種構象相比顯然是一種更加松散的結構[29]。本研究結果與文獻報道[16-17]的相似，表明適當的水熱處理可使植物蛋白二級結構中無規則卷曲的含量增加。α-螺旋和β-轉角都呈緊密無空腔結構，對蛋白酶的水解作用有很強的抵抗力，而β-折疊的緊密程度和構象穩定性都相對較低，因此酶解敏感性較高[30]。此外，值得注意的是與對照PPI相比，雖然HPPI中β-折疊總含量增加，但是1 685 cm-1處的β-折疊含量卻下降了。據Cruz-Angeles等[23]研究發現，1 682～1 700 cm-1處的β-折疊要比1 615～1 637 cm-1處的β-折疊結構更加緊密。由上述結果分析可知，水熱預處理可使花生分離蛋白二級結構變得松散、緊密程度下降。另一方面，HPPI-105 MPa的無規則卷曲含量顯著（P＜0.05）低于HPPI-90 MPa，表明水熱壓力過高可能會導致蛋白二級結構重新聚集。

圖4 水熱預處理前后花生分離蛋白紅外光譜中酰胺I帶擬合曲線Fig.4 Deconvoluted infrared amide I band of unpretreated and hydrothermally pretreated peanut protein isolate

表5 水熱預處理前后花生蛋白二級結構百分比Table 5 Secondary structure percentage of unpretreated and hydrothermally pretreated peanut protein isolate %

熒光光譜和紅外光譜分析結果都表明水熱處理后PPI的空間構象發生了明顯變化，適當壓力的水熱處理可使其三級結構展開、二級結構緊密程度下降。這可能是因為水熱處理破壞了維持蛋白質高級結構的次級鍵和二硫鍵，從而使花生蛋白的高級結構展開、蛋白聚集體破碎。此外，如前所述水熱處理過程中，PPI發生了輕度自發水解，使其分子量降低、帶電基團增多，也可能是其空間構象變得松散的重要原因之一。與致密的蛋白結構相比，松散的蛋白結構顯然具有更多的酶解位點，而且空間位阻較小，更容易與蛋白酶接觸反應，因此具有更高的酶解敏感性[30-31]。

3 結 論

1）利用Design Expert 8.0.6設計軟件中Box-Behnken模型對水熱預處理條件進行了優化，經檢驗證明該模型是合理可靠的（R2=0.97＞0.95），能夠較好地預測花生分離蛋白酶解產物的水解度。優化后的水熱預處理條件為水熱壓力90 MPa、溫度85℃、時間20 min，此條件下酶解產物水解度為16.3%，相對未經預處理的酶解產物提高了8.1個百分點。

2）水熱預處理提高了花生分離蛋白（peanut protein isolate，PPI）主要組分花生球蛋白和伴球蛋白的酶解敏感性，使更多的花生蛋白可被Protamex酶解而變得可以溶解。在最優水解預處理條件下，酶解產物蛋白質回收率為73.4%，相對未經預處理的酶解產物提高了31.9個百分點。

3）水熱處理后，PPI的空間構象發生了明顯的變化，適當壓力的水熱處理可使其三級結構展開、二級結構緊密程度下降，可能是其酶解感性提高的主要原因。

綜上所述，水熱預處理是一種輔助提高花生分離蛋白酶解效率行之有效的方法，可使酶解產物水解度和蛋白質回收率大大提高，為蛋白高效酶解改性提供技術參考和理論依據。

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Hydrothermal pretreatment improving proteolysis efficiency of peanut protein isolates and its mechanism analysis

Chen Lin1,Chen Jianshe2,Yu Hongpeng1,Wu Kegang1※
(1. Department of Food Science,College of Chemical Engineering and Light Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006,China;2. School of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310018,China)

The use of peanut protein has attained an increasing attention,primarily attributed to its high nutrition value,steady supply,and low cost compared with other proteins with different sources. Peanut protein isolate(PPI) is the most refined peanut protein product,containing 90% protein on a moisture-free basis,and is used as a kind of important protein material in food industry. However,the poor protein solubility and functional properties of commercial PPI limit its application in food and non-food products. Because of small side reactions and safeness,proteolysis has been widely used to improve protein functionalities and to prepare bioactive peptides. However,peanut proteins are resistant to proteolysis due to their compact structures that protect many of the hydrolysis sites. Recently,several studies have reported that hydrothermal treatment could not only alter the spatial conformations of globular proteins,but also break up protein aggregates into smaller pieces,which may cause the exposure of previously buried hydrolysis sites. However,little work has been done so far to investigate this possibility. Therefore,this work aimed to investigate the influences of hydrothermal pretreatment on the proteolysis pattern and the structure of PPI. Hydrothermally cooked PPI(HPPI) was prepared using a CJ-200 autoclave,and protease Protamex was used for the preparation of PPI hydrolysates(PPIH) and HPPI hydrolysates(HPPIH). Response surface methodology(RSM) was used to optimize the processing conditions of hydrothermally cooking,and the optimal conditions were as follows:the pressure was 90 MPa,the temperature was 85 ℃,and the time was 20 min. The actual degree of hydrolysis(DH) of HPPIH obtained under this pretreatment condition was 16.3%±0.2%,which was not significantly different(P＞0.05) from the predicted value(DH=16.2%). And the analysis of variance of the regression equation for the response surface quadratic model showed that the sequence of the importance for influential factors was pressure ＞ temperature ＞ time. The analysis of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) profiles of PPI,HPPI,PPIH and HPPIH showed that hydrothermal pretreatment substantially improved the enzymatic accessibility of the major subunits of conarachin and arachin in PPI,which were initially resistant to Protamex hydrolysis. As a result,more peanut proteins in HPPI could be readily hydrolyzed and become soluble,causing a strong increase in protein recovery(PR) for HPPIH. Under the 90 MPa pressure,HPPIH showed a much higher PR of 73.4% than that of PPIH(PR=41.5%). In addition,it was somewhat surprising that the observations of SDS-PAGE profiles and DH measurement both showed that hydrothermal pretreatment enhanced the spontaneous hydrolysis of PPI. Analysis of the intrinsic emission fluorescence spectra of PPI and HPPI demonstrated that compared with the control PPI,HPPI showed a decrease in the intensity of the fluorescence peak at 323 nm,and a red-shift for the peak at 332 nm,which suggested that hydrothermal treatment caused the unfolding of tertiary structure for PPI. Analysis of Fourier transform infrared spectra(FTIR) of PPI and HPPI demonstrated that compared with the control PPI,HPPI showed a significant decrease in α-helix and β-turn,and an increase in β-sheet and random coil,which suggested that hydrothermal treatment could loosen the secondary structure of peanut protein. So it is inferred that the unfolded tertiary structure and the loosened secondary structure for HPPI after hydrothermal pretreatment may be the main causes for its improved enzymatic accessibility. In conclusion,this study shows that hydrothermal pretreatment is a highly effective technique to accelerate and enhance the proteolysis of PPI.

proteins;heat treatment;optimization;hydrothermal pretreatment;peanut proteins isolates;proteolytic susceptibility;protein conformation

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.038

TS201.1

A

1002-6819(2017)-01-0278-07

陳 林，陳建設，于泓鵬，吳克剛. 水熱預處理提高花生分離蛋白酶解效率及其機理分析[J]. 農業工程學報，2017，33(1)：278－284.

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.038 http://www.tcsae.org

Chen Lin,Chen Jianshe,Yu Hongpeng,Wu Kegang. Hydrothermal pretreatment improving proteolysis efficiency of peanut protein isolates and its mechanism analysis[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2017,33(1):278－284.(in Chinese with English abstract)doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.038 http://www.tcsae.org

2016-07-09

2016-10-30

廣東省科技計劃項目（2016A020210113）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（20134420120008）。

陳 林，男，廣東廣州人，講師，博士，2008年赴英國利茲大學研修，主要從事食品生物技術、蛋白質化學與工程方面的研究。廣州廣東工業大學輕工化工學院食品系，510006。Email：l.chen@gdut.edu.cn

※通信作者：吳克剛，男，貴州人，教授，博士，主要從事食品生物技術方面的研究。廣州廣東工業大學輕工化工學院食品系，510006。Email：kgwu@gdut.edu.cn