膠質瘤中異檸檬酸脫氫酶的檢測及其臨床意義

張成娟，魏 冰，馬 杰

(鄭州大學附屬腫瘤醫院、河南省腫瘤醫院分子病理科，河南 鄭州 450008)

膠質瘤中異檸檬酸脫氫酶的檢測及其臨床意義

張成娟，魏 冰，馬 杰

(鄭州大學附屬腫瘤醫院、河南省腫瘤醫院分子病理科，河南 鄭州 450008)

目的 分析異檸檬酸脫氫酶(IDH)在膠質瘤中的突變情況，探討IDH基因突變對膠質瘤的診斷和預后意義。方法 通過Sanger DNA測序法檢測膠質瘤中IDH基因突變情況，同時比較分析IDH突變在不同人群中的突變頻率以及對預后的影響。結果 20例膠質瘤患者中發現IDH突變7例，均為IDH1 R132H(C.395G>A)突變，突變率為35.0%；存在IDH突變的膠質瘤患者無進展生存期和總生存期優于IDH野生型患者。結論 IDH突變對膠質瘤的輔助診斷和預后判斷具有重要的臨床意義。

膠質瘤；異檸檬酸脫氫酶；基因突變

1 膠質瘤的診治現狀

膠質瘤是指起源于神經膠質細胞的腫瘤，是最常見的原發性顱內腫瘤，WHO中樞神經系統腫瘤分類將膠質瘤分為WHO Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤[1]。膠質瘤約占所有顱內腫瘤的45%，在兒童惡性腫瘤中居第2位，近30 a來，原發性惡性腦腫瘤發生率逐年遞增，年增長率約為1.2%，中老年人群尤為明顯。其中在原發性惡性中樞神經系統腫瘤中，膠質母細胞瘤(glioblastoma,GBM,WHO Ⅳ級)的發病率最高，占46.1%，且男性多于女性,其次是彌漫性星形細胞瘤，發病率為0.53/10萬。

目前，替莫唑胺同步放療聯合輔助化療已成為新診斷GBM的標準治療方案，但是，膠質瘤的整體治療效果欠佳。膠質瘤呈浸潤性生長，與正常腦組織界限不清，僅靠手術難以治愈，應結合放療和化療等綜合治療以延緩腫瘤復發，盡可能延長患者無進展生存期和總生存期，提高生活質量。但是由于血腦屏障等因素的影響，化療藥物和一般抗腫瘤的中藥治療效果也不理想，因此腦膠質瘤至今仍是全身腫瘤中預后最差的腫瘤之一。其中，成人高級別膠質瘤的1 a及5 a的總生存期分別為30%和13%[1]。在目前精準醫療的大背景下以及分子病理等新興學科的推動下，如何發現有效的膠質瘤診治分子靶點就顯得尤為重要，相關分子靶點的發現將對膠質瘤的預后預測以及對化療藥物的反應性等具有重要的科學意義和臨床應用價值。

2 膠質瘤中IDH基因突變的檢測

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是由IDH基因編碼的蛋白酶，是一類在三羧酸循環中起重要作用的酶家族。IDH蛋白酶通過氧化脫羧作用催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，脫下的氫進一步由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP+)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)接受生成NAD(P)H+H+。人類和其他真核生物既有NADP+依賴的IDH(IDH1和IDH2)又有NAD+依賴的IDH(IDH3)[2]。本研究中膠質瘤IDH基因突變的檢測我們采用腫瘤相關基因突變檢測試劑盒IDH1-IDH2(上海源奇生物醫藥科技有限公司)。

2.1 樣本處理 石蠟切片組織，去除表面3～5張，取手術大標本(2～3張)，內鏡、穿刺小標本(5～10張)，厚度3～5 μm，置于1.5 mL EP管中。用二甲苯及無水乙醇進行常規脫蠟并于100 ℃金屬浴中烘干，然后加入200 μL Buffer GA，20 μL Proteinase K充分混勻，置于56 ℃水浴消化過夜，依次按步驟用石蠟樣本提取試劑提取腫瘤DNA(北京天根生化科技有限公司)。2.2 PCR擴增 各反應體系配制：PCR反應液9.5 μL + MIX3 12.5 μL。從陰性對照、陽性對照、樣本DNA液中分別取3 μL，加入PCR預混液中，快速離心10 s，將其移至檢測區。PCR反應體系為25 μL，PCR擴增條件見表1。PCR產物需經瓊脂糖凝膠電泳觀察，如果各反應液的PCR產物條帶清晰單一(IDH1-127-132反應液的擴增片段大小在260 bp，IDH2-140反應液的擴增片段大小在274 bp，IDH2-172反應液的擴增片段大小在194 bp)，則認為該PCR產物擴增良好，可進行測序。

表1 PCR擴增條件

保溫40次循環保溫42℃，5min94℃，30s72℃，5min94℃，5min58℃，30s——72℃，1min—

2.3 PCR產物的酶解 對陽性標本，其PCR產物取5 μL，再加入2 μL SAP MIX，混勻。37 ℃ 60 min，80 ℃ 15 min，最后4 ℃保存。

2.4 測序PCR反應 選取陽性PCR酶解產物3 μL、測序試劑(bigdye)1 μL和測序引物2 μL。具體條件見表2。

表2 PCR反應條件

變性30次循環恒溫96℃，1min96℃，10s4℃—50℃，5s——60℃，4min—

2.5 測序產物的純化及分析 用乙醇常規純化測序產物，ABI 3130上機測序，然后使用測序分析軟件Chromas對結果進行分析。

2.6 結果 本研究共檢測腦膠質瘤患者20例，發現IDH1突變7例，均為IDH1 R132H(C.395G>A)突變，突變率為35.0%。見圖1～4。

3 IDH基因突變在腦膠質瘤中的臨床意義

人類IDH基因突變最早發現于成人多形性膠質母細胞瘤患者中[3]，后續有研究報道IDH1的突變也可存在于前列腺癌、大腸癌、肺癌、副神經節瘤，急性髓細胞性白血病等不同類型的腫瘤中[4]。近年來，隨著高通量基因測序技術的發展，腦膠質瘤分子病理學方面的研究取得了突破性進展，目前發現的IDH突變大多數位于酶催化活性中心的保守區域，且均為雜合型突變，最常見的突變位點是IDH1 R132和IDH2 R172，其中精氨酸突變為組氨酸(R132H)是IDH1最常見的類型，約占80%～90%。

2009年，Yan等[5]就發現IDH基因突變廣泛存在于腦膠質瘤患者中，且IDH突變患者的預后明顯優于IDH野生型患者。在2015年6月，Jeanette等[6]的研究表明在Ⅱ和Ⅲ級膠質瘤中，IDH基因突變與患者總體生存期獨立相關，且IDH突變患者的總生存期明顯優于IDH野生型患者，IDH和端立酶逆轉錄酶(telomerase reverse trarscriptase,TERT)同時突變的患者總生存期最長，同時TERT、IDH和1p19q陰性組的患者總體生存期比TERT和IDH雙重突變組或三重陽性組均明顯短。Yang等[7]觀察了274例膠質瘤患者基因突變與預后的關系，發現根據IDH和TERT的突變狀態，將膠質瘤分為4個分子病理學亞型，其預后明顯不同：IDH突變/TERT突變預后最好，其次為IDH突發/TERT野生，IDH野生/TERT野生預后較差，而IDH野生/TERT突變預后最差。同時，Zhang等[8]也發現腦膠質瘤中IDH基因狀態不同，患者對放、化療的敏感性也存在差異，研究結果表明在IDH突變組中術后接受放、化療患者的疾病無進展生存期比未接受放、化療患者明顯延長(P<0.001)，而在IDH野生型組中未發現此現象。

圖1 IDH1序列(R132)

圖2 IDH1突變序列(R132H)

圖3 IDH2序列(R140)

圖4 IDH2序列(R172)

IDH突變是膠質瘤發生過程中重要的基因突變事件，但是具體如何導致腫瘤變化尚不清楚[9-11]。目前，Flavahan等[12]研究表明，IDH突變型膠質瘤在粘連蛋白與CCCTC結合因子的結合位點表現超甲基化，處于中間的位點高度甲基化能導致不同尋常的三維染色體構象改變，由此突變的IDH干擾染色體拓撲結構，促進促癌基因表達。同時IDH蛋白能影響腫瘤代謝，產生2-羥基戊二酸依賴羥化酶，包括5-甲基胞嘧啶羥化酶的TET家族。但由于TET酶的下游受影響的基因較多，具體如何導致腫瘤的變化目前尚不清楚。

4 結語

最近10 a來，伴隨人類基因圖譜的繪制完成、基因突變和疾病關系認識的深化，精準醫療正向人們走來。精準醫療是在預防、診斷和治療疾病過程中根據個體差異提供個性化醫療服務。精準醫療通過對腫瘤發生分子基礎的研究對疾病風險評估、診斷分子分型和治療方案的設計產生重大影響，以達到降低疾病風險和更有效治療疾病，提高人類健康水平的目的。相比較傳統的形態病理學，分子病理學技術能夠提供更全面、更客觀的依據，從而更好指導腫瘤的靶向治療和預后評估。精準醫學是醫學科技發展的必然，分子病理學也必將在未來的醫療領域里扮演越來越重要的角色。IDH基因的檢測將為膠質瘤的診斷、治療和預后評估提供重要的依據，IDH突變是低級別膠質瘤和繼發性膠質瘤的重要標志物，IDH突變對輔助治療敏感性具有良好的預測作用，根據IDH、TERT突變劃分的膠質瘤分子病理學分型對評估患者預后具有極其重要的意義。

[1] 《中國中樞神經系統膠質瘤診斷和治療指南》編寫組. 中國中樞神經系統膠質瘤診斷與治療指南[J]．中華醫學雜志，2016，96(7)：485-509.

[2] Reitman ZJ,Yan H. Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in cancer: alterations at a crossroads of cellular metabolism[J].J Natl Cancer Inst,2010,102(13):932-941.

[3] Parsons DW,Jones S,Zhang X,et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme[J].Science,2008,321(5897):1807-1812.

[4] Green A,Beer P. Somatic mutations of IDH1 and IDH2 in the leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms[J].N Engl J Med,2010,362(4):369-370.

[5] Yan H,Parsons DW,Jin G,et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas[J].N Engl J Med,2009,360(8):765-773.

[6] Eckel-Passow JE,Lachance DH,Molinaro AM,et al.Glioma Groups Based on 1p/19q,IDH,and TERT Promoter Mutations in Tumors[J].N Engl J Med,2015,372(26):2499-2508.

[7] Yang P,Zhang W,Wang Y,et al. IDH mutation and MGMT promoter methylation in glioblastoma: results of a prospective registry[J].Oncotarget,2015,6(38):40896-40906.

[8] Zhang ZY,Chan AK,Ding XJ,et al. TERT promoter mutations contribute to IDH mutations in predicting differential responses to adjuvant therapies in WHO grade Ⅱ and Ⅲ diffuse gliomas[J].Oncotarget,2015,6(28):24871-24883.

[9] Labussière M,Boisselier B,Mokhtari K,et al. Combined analysis of TERT,EGFR,and IDH status defines distinct prognostic glioblastoma classes[J].Neurology,2014,83(13):1200-1206.

[10]Ichimura K,Pearson DM,Kocialkowski S,et al.IDH1 mutations are present in the majority of common adult gliomas but rare in primary glioblastomas[J]. Neuro Oncol,2009,11(4):341-347.

[11]Koh J,Cho H,Kim H,et al. IDH2 mutation in gliomas including novel mutation[J].Neuropathology,2015,35(3):236-244.

[12]Flavahan WA,Drier Y,Liau BB,et al. Insulator dysfunction and oncogene activation in IDH mutant gliomas[J].Nature,2016,529(7584):110-114.

Detection of Isocritrate Dehydrogenase and Its Clinical Significance in the Gliomas

Zhang Chengjuan,Wei Bing,Ma Jie

(DepartmentofMolecularPathology,HenanCancerHospital,Zhengzhou450008,China)

Objective To analyze the mutations of isocitrate dehydrogenase (IDH) in the gliomas,and to explore the diagnostic and prognostic significance of IDH gene mutations in gliomas.Methods DNA Sanger sequencing method was used to detect the mutation of IDH gene,and the mutation frequency of IDH gene and the effect of mutation on the prognosis in different populations were compared.Results IDH mutations were found in 7 cases with 20 cases of glioma,which were IDH1 R132H (C.395G > A) mutation,and the mutation rate was 35.0%; the progression free survival and overall survival were longer in the patients who had the IDH mutation than the patients who had the wild type of IDH gene.Conclusion IDH mutation has an important clinical significance in the diagnosis and prognosis of gliomas.

glioma; isocitrate dehydrogenase; gene mutation

國家自然科學基礎青年基金資助項目(編號：81602637)；河南省醫學科技攻關計劃項目(編號：201303192)

張成娟(1981-)，女，博士，主治醫師，主要從事腫瘤靶向治療相關基因檢測及其臨床應用的研究工作。E-mail:zcj2016@126.com

馬杰(1963-)，男，碩士，碩士生導師，主要從事腫瘤病理診斷及分子分型研究工作。E-mail:majie@memail.com.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.06.001

R735.3；R730.53

A

1673-5412(2016)06-0461-04

2016-08-10)