PICU重癥肺炎患兒機械通氣后肺泡灌洗液NF-κB表達及炎性因子水平變化的研究

周茉 陳建麗 徐艷霞 陳敏

(貴州省婦幼保健院/貴陽市兒童醫院兒童重癥醫學科，貴州 貴陽 550003)

PICU重癥肺炎患兒機械通氣后肺泡灌洗液NF-κB表達及炎性因子水平變化的研究

周茉 陳建麗△徐艷霞 陳敏

(貴州省婦幼保健院/貴陽市兒童醫院兒童重癥醫學科，貴州 貴陽 550003)

目的 觀察PICU重癥肺炎患兒機械通氣后支氣管肺泡灌洗液(BALF)中核因子-κB (NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、巨噬細胞炎癥蛋白(MIP-2)的表達及炎性因子水平的變化。方法 將60例患兒分為好轉和惡化兩組，采用固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA法)檢測肺泡灌洗液中TNF-α水平和人巨噬細胞炎性蛋白2(MIP-2)因子水平；用NF-κB免疫組化試劑盒測定NF-κB的表達情況。同時于機械通氣第2、 6天及拔管后第2天記錄呼吸力學指標，行X線檢查，記錄生命體征、血氣分析、生命體征及胸片等綜合分析。結果 好轉組患兒BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達在機械通氣后第6天及撤機后第2天明顯下降(P<0.01)，肺組織損傷情況明顯改善；反之，惡化組相關數據呈明顯上升趨勢(P<0.01)。機械通氣后BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2炎性細胞因子的表達與由機械通氣所致的肺生物傷呈正相關性。結論 炎癥反應為呼吸機相關性肺損傷的主要發病機制，NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達與VILI的發生、發展和預后有密切關系。監測上述細胞因子水平的變化，有助于改善預后、減輕機械通氣所致的肺生物傷。

PICU； 重癥肺炎； 肺泡灌洗液； 細胞因子

由機械性通氣引起的肺組織損傷(ventilator-inducedlung injury，VILI)主要的病理學特征為高通透性的肺水腫、中性粒細胞的聚集活化、肺泡出血及肺泡隔明顯增厚[1]。近年來，關于機械通氣造成的生物傷激活了炎癥細胞，并釋放了各類細胞因子及炎性介質，從而引發肺損傷的相關研究有了迅速發展[2]。就目前已發現的，參與肺損傷的炎癥細胞所釋放的細胞因子及炎性介質就多達十幾種，其中研究得最多的炎癥細胞分別是巨噬細胞和中性粒細胞，所涉及的細胞因子主要為TNF-α、IL-1β和IL-8等。這些炎癥細胞與細胞因子之間相互激活、相互作用，從而構成了一個非常龐大且復雜的網絡體系，不僅可引起肺損傷，且可通過血液循環釋放到全身，從而引起多器官功能發生障礙(MODS)[3-4]。本研究通過持續對患兒BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達及炎性因子水平的變化進行檢測，探討它們能否作為評估肺生物傷發生、發展的量化指標。

1 資料與方法

1.1 資料

選擇2013年12月至2014年12月在我院PICU住院并進行機械通氣且撤機1周后存活的重癥肺炎患兒60例，女性36例，男性24例；年齡0.5～13歲，平均(5±4.7)歲。60例患兒均符合兒科重癥肺炎診斷標準[5]。所有對象在納入前其父母或監護人均填寫知情同意書并獲得患兒同意。

1.2 方法

根據臨床表現、呼吸力學指標血氣分析、生命體征及胸片等綜合分析，將60例患兒分為好轉及惡化兩組，每組30例。于應用機械通氣的第2、6天及撤機后第2天對其BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2水平分別進行檢測和濃度對比，同時記錄潮氣量(VT)、每分通氣量(MV)、動態肺順應性(Crs)、呼氣阻力(R)、呼吸做功(WoB)等呼吸力學指標；行影像學檢查；記錄體溫(T)、心率(HR)、呼吸(R)、經皮動脈氧飽和度(SPO2)、血壓(BP)等生命體征；血氣分析：動脈二氧化碳(PaCO2)、動脈氧分壓(PaO2)；并計算氧合指數。重癥肺炎治療按第7版《諸福棠實用兒科學》有關診療指南進行。

1.3 BALF標本采集和標本制備

患兒在充分鎮靜下經氣管插管行支氣管肺泡灌洗術，灌洗時將37℃生理鹽水1 mL/(kg·次)注入氣管插管，復蘇囊加壓給氧，充分拍背后將灌洗液回抽，共灌洗2～3次，回收率>40%。取患兒雙側肺BALF，超低溫冷凍后送重慶金麥生物技術有限公司進行相關實驗室檢測。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)分別檢測第2、6天及撤機后第2天的NF-κB、TNF-α、MIP-2水平變化。TNF-alpha、MIP-2試劑盒均代購于eBioscience 公司，NF-kB試劑盒代購于Active motif 公司。

1.4 統計學方法

2 結 果

兩組患兒插管后第2天各細胞因子表達水平無明顯差異(P>0.05);插管后第6天好轉組細胞因子表達水平呈下降趨勢、惡化組呈上升趨勢(P<0.01)；撤機后第2天兩組各細胞因子水平差異有統計學意義(P<0.01)，且好轉組各項指標隨著時間的延長，其表達水平呈遞減趨勢，反之，惡化組呈遞增趨勢。見表1。

表1 兩組患兒機械通氣第2、6 d各細胞因子表達水平的比較(n=30)

注：插管后2 d比較*P>0.05；與插管后6 d比較：△P<0.01；與撤機后6 d比較▲P<0.01。

兩組患兒插管后第2天與第6天比較，各細胞因子表達水平差異均有統計學意義(TNF-α，P<0.05；NF-κB、TNF-α、MIP-2，P<0.01)。插管后第6天與撤機后第2天比較，兩組NF-κB、TNF-α、MIP-2水平差異均有統計學意義(P<0.01)。插管后第2天與撤機后第2天比較，兩組NF-κB、TNF-α、MIP-2差異亦均有統計學意義(P<0.01)。其中好轉組患兒NF-κB、TNF-α、MIP-2在機械通氣撤機后第2天較插管后第2天明顯下降(P<0.01)，三項指標隨著時間的延長呈遞減趨勢；而惡化組患兒三項指標同期明顯升高(P<0.01)，并隨著時間的延長呈顯著上升趨勢。見表2。

表2 兩組患兒機械通氣第2、6天各細胞因子表達水平的組內比較

注：插管后6 d與插管后2 d比較☆P<0.05,*P<0.01；撤機后2 d與插管后6 d比較△P<0.01；撤機后2 d與撤機后2d比較▲P<0.01。

3 討 論

VILI早期表現為機械性損傷，隨后可演變為以炎性細胞、細胞因子介導的生物傷[6]。有研究顯示，中性粒細胞是引起VILI的主要炎癥細胞，它在肺組織中聚集活化，并釋放大量的蛋白溶解酶、氧自由基及細胞因子等物質，當這些物質的釋放量超出機體的清除能力時，就會導致肺組織的病理性損傷[7]。

機械應力激發刺激自由基的產生，從而促進P-選擇素的胞外分泌，同時通過NF-κB激活后刺激血管細胞粘附分子的產生和炎癥反應[8]。有關實驗數據表明，NF-κB的信號轉導通路可介導機械通氣所致肺生物傷時許多細胞因子和炎性介質的釋放[9-10]。NF-κB還可活化結合編碼細胞因子如TNF-α等基因的啟動子或增加子的κB結合位點，調節這些基因的表達，進一步促進機械性肺損傷的發生。

大量實驗結果表明，TNF-α作為一種前炎癥細胞因子，不僅能增強中性粒細胞及嗜酸粒細胞的功能，還可以對其周圍細胞產生毒性作用，同時它也是一種十分重要的炎癥級聯反應的調節因子，在VILI的發病機制中起到十分重要的作用[11-12]。此外，有關實驗數據[13]表明， MIP-2在趨化中性粒細胞的聚集活化中起主導作用。

VILI不僅僅包括機械性損傷，還包括由多種炎癥細胞、細胞因子和炎性介質參與的生物性損傷。機械性損傷可誘發生物性損傷，而生物性損傷反過來又可加重機械性損傷，兩者相輔相成、相互促進。盡管呼吸機所致肺生物性損傷涉及的炎癥細胞和炎性因子很多，關系非常復雜，但它們可能通過共同的炎癥反應通路而引起肺組織損傷。本研究結果顯示，機械通氣后BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達與肺生物傷呈正相關性，具體表現為隨著重癥肺炎患兒病情的好轉或惡化，炎性細胞因子NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達也分別呈顯著遞減或上升趨勢。炎癥反應為VILI的主要發病機制，NF-κB、TNF-α、MIP-2的表達與VILI的發生、發展和預后有密切關系。監測對比機械通氣后BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2炎性細胞因子水平的變化，可作為判斷重癥肺炎患兒行機械通氣及藥物治療后療效及疾病轉歸的方法之一以及可在臨床上操作的一項量化指標；而對上述炎性細胞因子水平呈顯著上升趨勢者，應警惕病情有惡化的趨勢，需進一步尋找惡化原因并及時調整治療方案，這對改善預后、減輕VILI有一定的幫助。

[1] Ricard JD，Dreyfuss D，Saumon G. Ventilator-induced lung injury[J]．EurRespir J Suppl,2003，42：2-9．

[2] Dreyfuss D，Rieard J-D，Saumon G.On the physiologic and clinical relevance of lung-borne cytokines during ventilator-induced lung injury[J]．Am J Respir Crit Care Med ,2003,167：1467-1471．

[3] Ricard JD，Dreyfuss D，Saumon G. Production of inflammatory cytokines in ventilator-induced lung injury：a reappraisal[J]．Am J Respir Crit Care Med，2001,163：1176-1180．

[4] Chiumello D，Pristine GSlutsky AS．Mechanical ventilafion affects local and systemic cytokines in all animal model of acute respiratory distress syndrome[J]．Am J Respir Crit Care Med，1999，160：109-116．

[5] 兒童醫院獲得性肺炎管理方案(2010版)[J].中華兒科雜志,2011,49(2):106-115.

[6] Wheeler K，Klingenberg C，McCallion N．et al，Volume-targeted versus pressure-limited ventilation in the neonate．Cochrane Database Syst Rev，2010，10(11)：CD003666．doi：10．1002/14651858．

[7] Choudhury S，Wilson MR,Goddard ME，et a1.Mechanisms of early pulmonary neutrophil sequestration in ventilator-induced lung injury in mice[J]．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，287：902·910．

[8] Huang CS，Kawamura T，Peng X，et a1．Hydrogen inhalation redueed epithelial apoptcsis in ventilator-induced lung injury via a mechanism involving nuclear factor-kappa B activation[J]．Biochem Biophys Res Cormnun，2011，408(2)：253-258．

[9] Li LF,Ouyang B，Choukroun G,et a1．Stretch-induced IL-8 depends on c-Jun NH2-terminal and nuclear factor-KB-inducing kinases[J]．Am J Paysiol Lung Cell Mol Physiol，2003，285：464-475．

[10] Bhatmcharya S，Sen N，Yiming MT,et a1．High tidal volume ventilation induces proinflammatory signaling in rat lung endothelium[J]．Am J Respir Cell Mo1 Bio1，2003，28：218-224．

[11] 章琳,楊渭臨.沙利度胺對老年特發性肺纖維化患者BALF中IL-6、TNF-α、TGF-β1表達的影響[J]. 西安交通大學學報醫學版，2012,33(5):622-625.

[12] 楊俊玲,尹金植,李青山,等．實驗性肺纖維化小鼠IL-1和TNF-α的動態表達及其意義[J]．吉林大學學報醫學版，2007，33(3):522-525．

[13] Quinn DA，Moufarrej RK，Volokhov A，et a1．Interactions of lung stretch，hyperoxia，and MIP-2 production in ventilator-induced lung injury[J]．J Appl Physiol，2002,93：517-525．

Study on the expression of NF-κB and inflammatory factor in Broncho alveolar lavage fluid after mechanical ventilation in children with severe pneumonia in PICU

ZhouMo,ChenJianli*,XuYanxia,ChenMin.

PediatricIntensiveCareUnit,GuizhouProvincialChildren'sHospital,MaternalandChildHealthCareHospitalGuiyang550003,Guizhou,China.

Objective To observe the changes of clinical index, to explore the possibility of the expression of nuclear factor-κB(NF-κB), tumor necrosis factor alpha(TNF-α), macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) inflammatory factor genes, by observing the Broncho alveolar lavage fluid(BALF)in children with pneumonias in the PICU, as the quantitative indices of the development lung biotrauma. Methods Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to check the expressions of TNF-α and MIP-2 in BALF 2 days and 6 days after mechanical ventilation and 2 days after extubation. The expression of NF-κB protein in lung tissues was detected by immunohistochemistry for measurement. And at the same time，the parameters of respiratory mechanics, arterial blood gases and chest X-ray were monitored. In accordance with the analyses of the aforementioned data, sixty cases were divided into two groups, 30 cases in each. One was the improvement group, and the other was deterioration group. Results Compared to the improvement group 2 days after mechanical ventilation，the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 in BALF of patients in improvement group 6 days after mechanical ventilation significantly decreased (P<0.01)，and the pulmonary function significantly improved after 6 days of treatment． For patients in the deterioration group，the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 in BALF were significantly elevated (P>0.01) after 6 days of mechanical ventilation compared to 2 days later. The positive correlation between the expressions of TNF-α，NF-κB and MIP-2 in BALF of patients undergoing mechanical ventilation and the lung injury caused by mechanical ventilation. With the improvement of disease, the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 in BALF of the children with pneumonias significantly decreased. With the deterioration of disease, those expressions of inflammatory factors rose significantly.Conclusion Inflammatory response is the major pathogenesis of ventilation induced lung injury (VILI), there is close relationship between the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 and the development of VILI. And can be used to judge the curative effect and prognosis of the patients.

Pediatric intensive care (PICU)； Severe pneumonia； Broncho alveolar lavage fluid； Cell factor

貴陽市衛生局科學技術計劃項目及高層次創新型青年衛生人才培養計劃項目(筑衛科技合同字[ 2013 ]第創17號)

R725.6

A

1000-744X(2016)08-0807-03

2016-03-09)

△通信作者，E-mail：1165438489@qq.com